大肠杆菌嘌呤核苷磷酸化酶基因真核表达载体的构建及.docVIP

　　大肠杆菌嘌呤核苷磷酸化酶基因真核表达载体的构建及 【关键词】 大肠杆菌 　　Construction of Eukaryotic Expression Vector Containing E.coli Purine Nucleoside Phosphorylase and Its Expression in MKN45 Cells 　　Abstract：Objective To clone E.coli PNP gene, construct its eukaryotic expression vector and obtain positive MKN45 cell clones expressing E.coli PNP gene stably. Methods PCR amplification ed using primers based on E.coli PNP gene sequence from Genbank, E.coli genomic DNA as template .PCR product ed, the gene id in method. Results PCR yielded a fragment of 716bp and EPNP e digestion analysis shoounts of EPNP mRNA and shoid containing E.coli PNP gene . 　　Key RNA，前体药MePdR对转染EPNP的MKN45细胞有较强的细胞毒作用。结论 成功构建了大肠杆菌PNP基因的真核表达载体, 获得了稳定表达大肠杆菌PNP基因的MKN45细胞克隆,为PNP/MepdR自杀基因系统在胃癌基因治疗中的应用奠定了良好的基础。 　　关键词：大肠杆菌嘌呤核苷磷酸化酶;自杀基因；基因治疗 　　0 引言 　　随着现代生物技术的发展, 基因治疗已成为继肿瘤的手术治疗和放疗、化疗后的又一新途径。特别是自杀基因治疗为目前国内外研究的热点之一。大肠杆菌DeoD基因编码的嘌呤核苷磷酸化酶（PNP）能将无毒的前体药脱氧腺苷类似物分解产生剧毒的腺嘌呤类似物, 通过抑制DNA、RNA和蛋白质的合成,而引起细胞死亡。同时它能够通过产生极强的旁观者效应,不仅使转基因细胞被杀死,而且大量未转基因的细胞亦被杀死[1,2]。本文对大肠杆菌嘌呤核苷磷酸化酶(EPNP)基因进行分子克隆并构建到pcDNA3.1真核表达载体中, 并获得稳定表达EPNP基因的MKN45细胞克隆,为今后进一步研究自杀基因在胃癌基因治疗中的应用创造条件。 　　1 材料和方法 　　1.1 载体与菌株 大肠杆菌JM109和真核表达载体pcDNA3.1均购自Invitrogen公司。克隆载体pMD18T购自大连宝生物公司。 　　1.2 主要试剂 限制性内切酶Bam HI 和Hind III、T4DNA链接酶和TaqDNA聚合酶、DL2000 Marker均购自大连宝生物公司；凝胶DNA提取Kit和PCR产物纯化Kit购自Promega公司；LipofectaminTM Reagent、Geicin(G418 Sulfate) 及MePdR为Invitrogen公司产品；IPTG和Xgal购自上海生物工程公司。实验所用试剂均为进口或国产分析纯试剂。 　　1.3 目的基因的克隆 ①引物设计: 根据GenBank数据库提供的EPNP基因的核苷酸序列设计一对引物。为方便克隆,在上游引物和下游引物的5′端分别引入Hind III 和Bam HI 酶切位点。上游引物：5’ –ATCATAAGCTTATGGCTACCCCACACATTAATG3’下游引物：5ATATGGATCCTTACTCTTTATCGCCCAG3’②模板提取: 大肠杆菌JM109基因组DNA的提取,按文献[3]方法进行。③PCR: 94℃变性5min进入循环,94℃,60秒,56℃,60秒,72℃,120秒,经30个循环扩增后72℃延伸10min。取10μl PCR产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳进行初步鉴定。PCR产物的回收按PCR产物纯化Kit上的说明进行。回收产物保存于20℃备用。 　　1.4 PCR产物的克隆及测序 TA克隆载体pMD18T与胶回收纯化的PCR产物按1∶3(摩尔比)的比例在T4DNA连接酶作用下进行连接, 16℃反应16ｈ。取10μｌ连接反应液转化JM109感受态细菌,将转化的菌液涂在Xgal 处理过的含有氨苄青霉素的LB平板上培养12ｈ,在长出蓝、白克隆的LB平板上挑取白色克隆进行少量扩增、质粒小提, 用酶切初步鉴定阳性细菌克隆, 将酶切鉴定正确的细菌克隆送交大连宝生物公司测序。 　　1.5 真核表达载体pcDNA3.1EP