大肠杆菌表达人IL-21融合蛋白的纯化和抗原性分析 .docVIP

　　大肠杆菌表达人IL?21融合蛋白的纯化和抗原性分析 ：付强 钱冬萌 闫志勇 侯伟 王斌 【摘要】 目的 在大肠杆菌中表达人IL?21编码基因，并进行蛋白纯化和抗原性分析。方法 以经PHA刺激的人扁桃体细胞cDNA 文库为模板，经PCR获得IL?21全基因片段。测序确认后，分别设计含BamHⅠ和SalⅠ酶切位点的引物，经PCR获得IL?21成熟肽的编码基因。将此IL?21基因插入表达载体pGEX?4T?2，重组克隆经酶切与测序确认后转化大肠杆菌DH5α,进行IPTG诱导表达。经琼脂糖珠结合的纯化方法所得产物用ethodsHuman IL?21 gene fragments human tonsil cDNA by PCR. The coding gene for the mature N terminus of IL?21 ed into E.coli DH5α. The expressed product atography using GST Fusion Protein Purification bead and its antigenicity analyzed by 109、E.coli DH5α均为本室保存。PCR试剂、T4 DNA连接酶、PCR产物纯化试剂盒、pGEM?T Easy Vector 试剂盒均购自Promega公司。DNA限制性内切酶BamH Ⅰ、Sal Ⅰ 均购自Takara公司。引物均由北京赛百盛公司合成(PAGE纯化)，GST Fusion Protein Purification bead 购自Amersham公司。 　　1.2 IL?21全编码基因的克隆 将经PHA刺激培养48 h的人扁桃体细胞总RNA逆转录为cDNA后，进行PCR扩增。利用T4 DNA连接酶将7.5 μL PCR纯化产物与0.5 μL T?Easy载体连接。同时，使用TSS法制备感受态大肠杆菌JM109，将连接产物转化后在涂有X?Gal和IPTG的ALB固体培养基上培养,37 ℃放置12～16 h。 通过蓝白斑法选择阴性、阳性克隆，从中提取重组质粒DNA，采用 PCR和酶切初步鉴定后，进行DNA序列测定分析。 　　1.3 IL?21重组表达质粒的构建 利用含BamHⅠ和SalⅠ酶切位点的引物，经PCR获得IL?21成熟肽的编码基因。经过纯化的PCR产物及载体pGEX4T?2同时用核酸内切酶BamHⅠ和SalⅠ消化后以T4连接酶连接，构建原核重组表达质粒。对用TSS法新鲜制备的感受态E.Coli.DH5α进行转化。对转化长出的菌落进行质粒小提，用限制性内切酶进行初步鉴定后，进行DNA序列测定分析。 　　1.4 重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达 挑取单个重组成功菌落接种于5 mL Amp?LB中, 37 ℃震荡培养,当菌液吸光度达到0.4～0.6时,用终浓度为1 mmol/L的IPTG诱导目的基因在大肠杆菌DH5菌中的表达。分别于诱导后1、2、4 h取菌液3 mL，12 000 r/min离心1 min，沉淀用SDS凝胶加样缓冲液震荡后置沸水浴5 min，稍微离心，上清移至新管,-20 ℃储存备用。同时，用DH5α宿主菌和未诱导的含重组质粒的DH5α菌，以及诱导的含pGEX4T?2质粒的DH5α菌样品作对照行SDS?PAGE。 　　1.5 表达蛋白的纯化和arker。然后，参照分子克隆实验操作。一抗为IL?2的单克隆抗体，二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG。 　　2 结 果 　　2.1 目的基因的PCR扩增 PCR扩增的IL?21全编码基因长为642 bp，其中成熟N端编码基因长为396 bp。同DNA标准相对分子质量参照物相比，PCR扩增产物的大小与预测的结果一致（图1）。 　　2.2 原核重组表达质粒的鉴定 经PCR扩增出的IL?21成熟肽的编码基因片段和鉴定重组成功的质粒经双酶切后同时进行电泳，可见酶切产物和PCR扩增条带大小与理论 值相符（图2）。 　　2.3 表达蛋白的SDS?PAGE 经SDS?PAGE，考马斯亮蓝R?250染色观察，含重组质粒的诱导菌在相对分子质量为41 000位置出现一蛋白条带，而未诱导的重组质粒转化菌在相应位置没有蛋白条带；含质粒pGEX4T?2的诱导菌在相对分子质量为26 000位置出现一条带。目的基因表达的多肽相对分子质量估计为15 000，与融合蛋白共同表达相对分子质量约为41 000的多肽，与理论估计相一致。经凝胶成像扫描，融合蛋白产量占总蛋白的10%（图3）。 　　2.4 表达蛋白的纯化 大体积蛋白表达后，将细菌裂解液上清和纯化浓缩的蛋白进行电泳分析，结果显示得到理想的纯化融合蛋白条带(图4)。 　　2.5 表达蛋白