荧光定量PCR技术讲座20170904.pptVIP

内参基因的选择 特点 选择内参基因 内参基因 beta-actin、 GAPDH、 18S rRNA、 28S rRNA等 -- 文献检索 -- 实验筛选 选择多个备选内参基因，以备选内参基因的几何平均数作为均一化标准 内参基因Housekeeping Gene -- RNA抽提、反转录为cDNA的效率不同，用于定量分析的样本初始浓度不同。 对样本初始浓度差异进行均一化校正。 不同环境，不同器官、组织、细胞类型之间，表达量相对恒定。 Housekeeping Gene 康为产品 不同丰度： 高丰度 ACTB、GAPDH 中等丰度 beta2M 低丰度 HPRT1 不同物种： 人、大鼠、小鼠、猪、牛、羊、鸡、斑马鱼、甘蔗 等 基因表达分析检测 样本处理与 RNA提取 – cDNA – qPCR 内参基因(housekeeping gene)选择 样本处理与RNA提取 外界刺激 – 10分钟 – 可检测的表达改变 样品离开定义环境 – 2分钟内 –固定、裂解细胞 RNA样本保存液 Trizol 超纯RNA提取试剂盒 RNA的评价与鉴定 - 完整性 - 纯度 小心DNA污染！ - 使用DNaseⅠ - 引物设计 - 以RNA作PCR阴性对照 CW0580 CW0592 CW0581 CW2090A RT-qPCR一步法还是两步法？ 两步法：步骤多但灵活多样。cDNA可长期保留，检测多个基因，便于反应条件的优化。 推荐：工作的初期阶段，以及单个样本多个靶基因检测。 一步法：简单、灵敏度高，有效减少实验操作误差和污染。每次只能做一个基因。 推荐：工作的成熟阶段，以及多个样本单个靶基因检测。 逆转录 逆转录引物选择 下游应用：是否检测其它基因？ Abundant RNA的干扰：mRNA or total RNA？ 检测灵敏度是否足够？ 逆转录酶 SuperRT 逆转录酶（RNase H-） HiFi-MMLV逆转录酶（RNase H-） 引物 特异性 反应效率 Oligo dT 中 低 Random hexmer 低 中 Specific primer 高 高 CW0741 CW0743 总原则与普通PCR相同： 避免引物二聚体，避免二级结构 扩增片段长度（80 – 300 bp) 推荐做跨intron设计 引物设计原则 EXON 1 EXON 2 INTRON 2 DNA EXON 1 EXON 2 RNA 反应条件优化 内参基因 – 目的基因 -- 融解曲线：单一特异性产物 -- 扩增曲线：Ct值 -- 标准曲线： 扩增效率尽量高，目的基因 尽可能接近内参基因 反应条件优化 融解曲线分析 -- 单一特异性产物 将温度对荧光强度的变化求导 图2 Effciency slope 内参基因 100% -3.32 目的基因 Primer 2 78% -4.00 图1 Effciency slope 内参基因 100% -3.32 目的基因 Primer 1 95.36% -3.43 标准曲线分析 -- 扩增效率尽量高 -- 目的基因尽可能接近内参基因 10%以内 反应条件优化 反应条件优化 扩增曲线分析 -- Ct值 Master Mix的应用 -- 热启动酶 化学修饰，常温下完全没有聚合酶活性，热复活需95℃ 10分钟 -- GoldStar、HotStar 非化学修饰（Oligo修饰、抗体修饰、Mg2+螯合物） 热复活仅需95℃几十秒 --FastStar -- Buffer 反应增强剂 -- 减少引物二聚体，进一步提高反应特异性 -- 对于复杂模板，提高反应效率 稳定剂 -- dNTP Master Mix的应用 ROX Passive Reference 不参与、不干扰PCR反应 恒定发射荧光信号 用于校正因信号检测器到各孔间光路不同而导致的系统误差。 需参照仪器要求选择。 误差控制 使用Master mix 配置预混体系 设置生物学重复 （不同个体） 技术性重复（复孔） 阴性对照 荧光定量PCR体系 2-ΔΔ Ct法 满足条件：1）内参基因和目标基因的扩增效率接近-正负10%