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分析化学Ⅱ 第十一章 荧光分析法 　　　分析化学教研室 荧光分析法（Fluorometry) 11.1 概述 续前 11.2 基本原理 11.2.1 分子荧光光谱的产生 续前 续前 二、荧光的产生 1、振动弛豫（vibrational relexation） 2、内部能量转换（internal conversion) 续前 处于激发态的电子，通过振动弛豫和内部能量 转换，均回到第一激发态的最低振动能级 过程：振动弛豫→内部能量交换→振动弛豫 3、体系间跨越（intersystem crossing) 续前 4、荧光（fluorescence） 硫酸奎宁的激发光谱和荧光光谱 5、磷光（phosporescence） 6、外部能量转换（external conversion) 续前 11.2.2 激发光谱与发射（荧光）光谱 荧光光谱的特点（重点） 镜像关系的原因 11.2.3 分子结构与荧光的关系 2.分子结构对荧光的关系 续前 11.2.4 影响荧光强度的外界因素 续前 3、pH影响 对酸碱化合物，溶液pH的影响较大，需要严格控制； 4、荧光熄灭的影响 荧光物质与溶剂分子或其它溶质分子相互作用引起荧光强度降低或熄灭的现象。引起荧光熄灭的物质为荧光熄灭剂 常见的熄灭剂有：卤素离子、重金属离子、氧分子以及硝基化 合物、重氮化合物、羰基化合物。 续前 硫酸奎宁在不同激发波长下的荧光(a)与散射光谱(b) 11.3 荧光定量分析 2、荧光强度与浓度关系：（稀溶液） 荧光强度F与溶液吸收光能的程度以及溶液中荧光物质的量子效率有关。 若荧光物质浓度很小，满足Ecl0.05时，荧光强度与荧光物质浓度成正比 11.4 荧光分析技术及应用 续前 续前 小结： 掌握 基本概念：荧光、振动弛豫、内部能量转换、外部能量转换、体系间跨越及磷光；激发光谱与荧光光谱 基本理论：溶液荧光光谱的特征；物质发射荧光的条件；荧光定量分析的依据、条件及方法 熟悉：影响荧光强度的因素（分子结构和外界条件） 了解 荧光分析仪器 练习： P297，思考题 3、5，8 5、散射光的干扰 散射光:当一束平行光照射在液体样品上，大部分光线透过溶液， 小部分光线由于光子和物质分子相碰撞，使光子的运动方 向发生改变而向不同角度散射，这种光称为散射光。 瑞利光:光子和物质发生弹性磁撞时，不发生能量交换，仅光子方 向改变，这种散射光称为瑞利光。其波长与入射光相同。 拉曼光:光子和物质发生非弹性磁撞，光子改变方向同时，与物质 有能量交换，散射光波长有所改变，增大或减小，这种散 射光为拉曼光。 波长增大的拉曼光对荧光测定有干扰 荧光光谱 散射光谱 瑞利光320nm 拉曼光360nm 拉曼光400nm 荧光448nm 激发320nm 激发350nm 瑞利光350nm 返回 F = k (I0 - I)=KC 1、荧光测定方向：激发光源垂直方向，避免透射光干扰。 受激后，可在各个方向发射荧光，在透过光的方向不易测定F。 返回 1、荧光仪器简介： 四个部分：激发光源、样品池、双单色器系统、检测器。 （1）光电荧光计 高压汞灯 透镜 样品池 第一滤光片 第二滤光片 光电管 电表 光电荧光计光路图 高压Hg灯，产生线光谱 将不需要的光滤去 低荧光的玻璃或石英制成，四面透光。 只让荧光照射到检测器上 （2）荧光分光光度计 氙灯 样品池 检测器 荧光分光光度计光路图 固定激发波长λex ，扫描荧光光谱，找荧光光谱λmax 。 固定荧光光谱λmax，扫描激发光谱，找激发光谱λmax 。 固定激发光谱λmax 。扫描荧光光谱，找荧光光谱λmax 。 （3）荧光光电计与荧光分光光度计的比较 石英、玻璃池（低荧光的玻璃） 样品池 光电倍增管 检测器 光栅 第二滤光片 发射单色器 光栅 第一滤光片 激发单色器 氙灯 汞灯 激发光源 荧光分光光度计 光电荧光计 返回 * * * 概 述 荧光定量分析方法 荧光分析技术与应用 基本原理 小 结 水溶性荧光黄 无辐射跃迁 放出热能或动能 物质基态 光照射 激发态 光致发光 发射荧光和磷光 物质基态 吸收 特定光 荧光分析法：基于对化合物的荧光测量建立起来的分析方法 荧光测量包括：荧光谱线位置及荧光强度 选择性 灵敏度 本质 一般 高 10-5~10-7g/ml 10-8~10-10g/ml 吸收光谱 发射光谱 不同点 分子光谱 分子光谱 相同点 可见紫外 荧光 荧光分析法与可见紫外吸收光谱比较 原子荧光法（Atomic Fluoromet