生物化学蛋白质化学(二)3资料.pptVIP

* * 2.福林试剂反应（酚试剂反应） 福林试剂：磷钼酸-磷钨酸 在碱性条件下，蛋白质与硫酸铜发生反应 蛋白质-铜络合物，将福林试剂还原，产生磷钼蓝和磷钨蓝混合物 * * 3.乙醛酸反应 在蛋白质溶液中加入HCOCOOH，将浓硫酸沿管壁缓慢加入，不使相混，在液面交界处，即有紫色环形成。 色氨酸的反应（吲哚环的反应） 鉴定蛋白质中是否含有色氨酸 * * 4.茚三酮反应 在PH5.7时，蛋白质与茚三酮可产生颜色反应。可用于蛋白质的定性和定量。 * * 六、蛋白质的免疫学性质 抗原：指能刺激机体免疫系统产生免疫应答，并能与相应的抗体特异性结合的物质。 抗体：由相应抗原刺激机体的免疫系统而由β-淋巴细胞新产生的免疫球蛋白。换句话说，抗体是动物针对外来物质的出现而合成的一种蛋白质。 免疫反应：指抗原与抗体所引起的反应。 过敏反应：免疫反应拌有组织损伤或生理功能紊乱。 * * 第五节　蛋白质的提取、分离和纯化的基本原理 蛋白质的分离纯化是研究其结构与功能的基础。在生物制药工业中，蛋白质、酶、多肽类激素等药物生产制备都涉及到蛋白质分离纯化的问题。蛋白质分离纯化的工艺过程，既要考虑尽可能的除去杂蛋白，又要保持目的蛋白的产量，也就是要提高回收率。 * * 一、提取 1.选材：新鲜、富含目的蛋白且来源方便 2.组织细胞的粉碎：胞内及膜中蛋白 1）物理法：如超声、匀浆、加砂研磨、高压挤压等 2）化学法：如EDTA、SDS等 3）酶法：如自溶法、外加酶法（纤维素酶、果胶酶、溶菌酶等） 3.提取：适当溶媒、适当条件、适当提取时间和次数、溶菌酶处理（分解肽聚糖）或用表面活性剂处理。 * * 二、分离纯化 从组织细胞中提取的蛋白质溶液，含有许多不同分子量的蛋白质，要获取目的蛋白，须进一步分离纯化，将目的蛋白质与其它蛋白质分开。 分离原理及原则：利用欲分离蛋白质的溶解度、分子大小、电荷、吸附性质、对配体分子的特殊的亲和力。从混杂蛋白质中分离出一个特殊蛋白质。 * * 基本步骤 选材 组织细胞破碎：机械法、物理法、化学法、酶法。 提取：选用适当的溶剂 分离纯化：根据等分离蛋白质的特异理化性质设计分离纯化方法。 结晶：结晶过程本身也伴随着一定程度的纯化。 鉴定、分析：纯度、含量、相对分子质量等。 * * （一）根据溶解度不同的分离方法 利用各种蛋白质的溶解度差异进行分离。影响蛋白质溶解度的因素有PH值、离子强度、溶液的介电常数等，各种蛋白质的溶解度取决于它们的分子结构，如：氨基酸组成、极性和非极性基团的多少等。 * * 1.等电点沉淀 蛋白质在PI使溶解度最小， 此方法常与其它分离方法配合使用。 * * 2.盐析沉淀 不同蛋白质可通过加入不同饱和度的中式盐分别沉淀出来（即分级沉淀）。 常用饱和硫酸铵来沉淀蛋白质。此法可用于工业大规模分离。 * * 3.低温有机溶剂沉淀 利用有机溶剂能降低在Pro水中的溶解度，使蛋白质沉淀。 常用的有机溶剂有乙醇、甲醇、丙酮等。在低温下操作，有机溶剂一般需预冷（-40℃），缓慢加入。 * * 温度对蛋白质溶解度的影响：在一定范围内，0~40℃之间，大部分球状蛋白质随温度升高而溶解度增大（血红蛋白除外，0~25℃随随温度升高而溶解度降低）；在40~50℃以上，大部分蛋白质不稳定，开始变性。所以大多数蛋白质的分离在低温下操作。 * * （二）根据蛋白质分子大小不同的分离方法 1.透析:是将待提纯的Pro溶液在装在半透膜的透析袋里，放入 蒸馏水中进行的，透析液可以进行更换，直至透析袋内无机小分子物质降到最低点为止。 超滤:是利用压力或离心力，强行使水和其他小分子物质通过半透膜。而蛋白质截留在膜上。市场上有各种规格的半透膜出售，可根据目的蛋白的分子量选择不同孔径的膜。 * * 2.分子筛层析（凝胶过滤、排阻层析） 又称凝胶过滤、分子排阻层析，它是根据分子量大小分离混合物最有效的方法之一。 凝胶过滤所用的介质是凝胶珠，内部是多孔的网状结构。凝胶的胶联度或孔度（网孔大小）决定凝胶的分级范围，即能被该凝胶分离开来的Pro混合物的分子量范围。 * * 3.密度梯度离心 每种蛋白质颗粒沉降到与自身密度相等的介质密度梯度时，即停止不前，在离心管中被分离成各自独立的区带。 常用的密度梯度有蔗糖梯度、聚蔗糖梯度等。 密度梯度在管内分布是管底的密度大，向上逐渐减少，待分离混合物平铺在梯度的顶端，离心采用水平转头高速进行。 * * （三）根据蛋白质带电性的分离方法 在一定PH下，不同蛋白质所带的电荷数量和性质不同。 * * 1.电泳 在外电场作用下，带电颗粒向与其电性相反的电极移动。带电颗粒在电场中的泳动速度取决于它所带的净电荷量以及颗粒的大小和形状。 常用电泳的方法有： 1）醋