产碱性磷酸酶菌株的分离剖析.ppt

产碱性磷酸酶菌株的分离 1.碱性磷酸酶简介 2.设计原理 3.实验材料 4.设计思路 5.实验步骤 碱性磷酸酶简介： 碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase， EC 3.1.3.1，简称AP ）是一种底物专一性较低的非特异性磷酸单酯酶，几乎能催化所有的磷酸单酯的水解反应，产生无机磷酸和相对应的醇 酚或糖 AP被广泛用于分子生物学研究 医学临床检验 食品检验 化妆品制造 环境毒物检测及有机磷农药降解中 实验设计原理： 目前应用较广的是牛小肠碱性磷酸酶和E.coli碱性磷酸酶[4]。但因产率低、热稳定性差，价格昂贵等问题，使其的大量使用受到了限制。本实验通过微孔板法初筛，磷酸苯二纳法测酶活复筛的方法来阐述对产碱性磷酸酶菌株的分离。 材料： 试剂： (l)0.lmol/L碳酸盐缓冲液(pH10.0)称取无水碳酸钠0.649、碳酸氢钠、3.49、 4一氨基安替比林0.159,定溶于100ml蒸馏水中。 (2)0.02mol/L磷酸苯二钠溶液称取二水磷酸苯二纳0.519,使其定容于100ml 沸水中,冷却后加入0.sml的氯仿。置冰箱保存。 (3)铁氰化钾溶液称取铁氰化钾0.259、硼酸1.79,各溶于40ml水中,二液 体混合后定容至10枷1。置冰箱保存。 以上试剂置冰箱保存一般不超过一周,每次都尽量现配现用。 主要仪器： 冷冻离心机、恒温培养箱、 电热恒温水浴锅、数控超级恒温槽、 精密pH计、分光光度计、超声波细胞粉碎机 实验方法： 菌株的分离，初筛磷酸酶产生菌 复筛磷酸酶产生菌 产酶菌株碱性磷酸酶活力测定 菌株的产酶时间 不同pH缓冲溶液对酶活的影响 酶的热稳定性试验 菌种的分离与产酶菌株的初筛 从湖边、花坛和竹林中3处取土样适量，加入10mL无菌水，25℃摇床振荡30min，取上清液作系列稀释，分别取0.2mL涂布LB培养基上，置于30℃培养24h，将长出的菌落分别命名。磷酸苯二钠比色法初测碱性磷酸酶活性。将0.lmol/L碳酸盐缓冲液(含4-氨基安替比林,pH10.0)50ul点样于40孔微孔板中(对照孔加量为55ul), 取各菌种等量菌苔与缓冲液充分混匀,于37℃水浴5min。再加入磷酸苯二钠溶液(0.02mol/L)50ul,37℃反应15min。加入铁氰化钾溶液150ul,显色并终止反应。重复二次。以红色深浅初筛磷酸酶产生菌。 产酶菌株的复筛 将AP强阳性菌株接于20mL基础培养基中30℃培养20h，将培养好的菌液以10%接种量接入80mL发酵培养基中培养，16h后离心，收集上清用于测胞外酶活。沉淀用5mL0.1mol/L的Tris-HCl缓冲液制成细胞悬液，超声破碎，离心后上清用于测胞内酶活。计算单位体积发酵液胞内和胞外AP酶活。 产酶菌株碱性磷酸酶活力测定 采用AP活性检测试剂盒。具体操作为将1mL反应液R1加到比色皿中，37℃孵育3min后加入20μL待测样品，搅匀并保温30s，再加入250μL反应液R2到比色皿中，搅匀并 保温30s，然后用分光光度计测定波长405nm处2min内的吸光度值变化。酶活性计算：碱性磷酸酶 AP（U/L）：△A/min×Vt×1000/ （e×Vs×d）=△A/min×F式中：△A/min：每分钟吸光度值变化率；Vt：反应液总体积，mL；1000：变化系数；e：6.22（摩尔吸光系数）；Vs：标本体积，mL；d：比色皿直径，cm。 酶活定义：37℃条件下每分钟产生1μmol游离酚的酶量为一个酶活单位（U）。 产酶菌株碱性磷酸酶活力测定 取目的菌种接于10mlLB培养液中摇床培养过夜,取菌悬液1ml接种于20mlLB培养液中,30℃,150r/min摇床培养,于24h,48h分别各取5ml发酵液高速冷冻离心,6℃、5000rpm、10min。收集上清液(细胞外酶),备用。细胞沉淀用生理盐水洗涤一次,离心6℃、5000rpm、10min。弃上清,取细胞加5ml0.lmol/L碳酸盐缓冲液制成细胞悬液,冰水浴超声波粉碎细胞(120w,处理3s间隔6s,处理100次)。离心6 ℃ 5000rpm、10min收集上清液(细胞内酶),备用。 磷酸苯二钠比色法测试碱性磷酸酶活性:分别取细胞外和细胞内上清酶液0.smL加入到1.OmL含有0.15%4一氨基安替比林的碳酸盐缓冲液(0.1M,pH10),37 ℃水浴smin,再加入0.02M磷酸苯二钠1.0ml37 ℃水浴15min后立即加入3ml铁氰化钾溶液显色立即充分混匀,用分光光度计于510nm波长处比色,用蒸馏水调零。以未接种的培养液为对照。 酶活定义为:37℃下每分钟产生1umol游离酚的酶量为一个酶活单位助。 菌株的产酶时间 接菌株于基础培养液,每隔一定时间取样测酶活,并同时测细胞生长量。由于发酵液非匀