（原核表达载体的启动子） 5.ppt

第一节 制药基因的克隆第二节 重组蛋白表达系统第三节 蛋白的分离纯化第四节 转染技术第五节 融合标签第六节 已投入市场的基因工程药物第七节 生物技术药物在动物医学中的应用 制药基因的克隆是指应用基因工程技术手段得到制药基因的过程 ① 制药基因的获得； ② 制药基因与载体分子的体外连接反应； ③ 将该人工重组DNA分子导入到能够正常复制的宿主细胞中进行扩增； ④ 阳性重组子的筛选和鉴定； ⑤ 重组子的表达以及蛋白的纯化与鉴定等五大步骤。 一、 制药基因的获得 1、 mRNA的纯化 2、 cDNA 第一链的合成 3、 cDNA 第二链的合成 4、 建立cDNA 文库 （质粒文库、病毒文库） 5、 扩增cDNA 6、 cDNA 文库质量的鉴定 7、 目的cDNA （基因）克隆和鉴定 cDNA 第一链和合成 cDNA 第二链和合成（self priming) cDNA 第二链合成（replacement synthesis of the second strand of cDNA) RT-PCR 直接分离目的基因 1 制备mRNA 注意 RNase 污染 2 制备first strand cDNA 用Moleney murine reverse transcriptase 3 根据目的基因的DNA顺序设计PCR引物 18-25 核苷酸 4 PCR扩增， Denature temp, annealing temp and extension temp 二、制药基因与载体分子的体外连接 （一）载体分子 1、载体的概念和一般特征 载体就是具备自我复制能力的DNA分子。 一般具有如下特性： （1）能在宿主细胞内进行独立和稳定的自我复制，尽管有外源基因插入，这种稳定的复制状态和遗传特性不会改变。 （2）易于从宿主细胞中分离、纯化。 （3）具有较小的分子量和松弛型复制子。 （4）在载体DNA分子复制的非必需区内，存在有适当的限制性内切酶位点，最好是单一酶切位点，可供插入外源DNA分子，但不影响载体自身的复制。 （5）具有能够观察的表型特征，如报告基因，这些表型特征可以作为筛选阳性重组DNA的标志。 2、载体的报告基因 最常用的报告基因有抗药性基因， 抗氨苄青霉素、 抗卡纳霉素、 抗四环素、 抗氯霉素等抗生素基因， 氯霉素乙酰转移酶基因（CAT基因）、 lacZ基因、 绿蛋白基因、 发光基因（lux） 3、载体分子的分类 3、载体分子的分类 （1）克隆载体 细菌质粒 噬菌体载体 酵母克隆载体 病毒载体 （2）表达载体 ① 非融合蛋白表达载体 ② 融合蛋白的表达载体 （1）克隆载体 表达载体应具有的特征： ① 能够独立地复制（origin of replication）； ② 应具有灵活的克隆位点（multiple cloning site or polylinker）； ③ 具有方便的筛选标记（selectable marker），有利于外源基因的克隆、鉴定和筛选； （2）表达载体 表达载体应具有的特征： ① 能够独立地复制（origin of replication）； ② 应具有灵活的克隆位点（multiple cloning site or polylinker）； ③ 具有方便的筛选标记（selectable marker），有利于外源基因的克隆、鉴定和筛选； ④ 如果在大肠杆菌中表达，则应具有很强的启动子（promoter），能为大肠杆菌的 RNA 聚合酶所识别； ⑤ 应具有阻遏子（suppressor），使启动子受到控制，只有当诱导时才能进行转录； ⑥ 应具有很强的终止子（terminator）； ⑦ 所产生的 mRNA 必须具有翻译的起始信号，即起始密码AUG（start codon）和核糖体结合位点。 第二节 重组蛋白表达系统 基因表达: 定义：外源基因(exogenous gene)在生物体内的转录(transcription)，翻译(translation) 和加工过程(post translation modification)的过程。 基因表达的重要参数： 产量（yield)、生物活性(bioactivity)、理化性状、可溶性(solubility)等 表达系统： 原核表达系统；真核表达系统 （二）筛选标记 目前应用于大肠杆菌载体的选择标记大多是抗生素的抗性基因，常见的有抗氨苄青霉素、四环素、氯霉素和卡纳霉素等抗性基因。 （四）核糖体结合位点 (ribosome-binding site) SD （Shine-Delgarno Sequence） 起始密码上游3～11bp处。 SD序列为UAAGGAGG， AAGGA为核心，起始密码 ATG与SD最适距离为6～8bp，