汉恒-悬浮细胞专用腺病毒操作技术.pdfVIP

汉恒悬浮细胞专用腺病毒操作技术文档 腺病毒基本操作请参考“汉恒腺病毒操作手册”，但悬浮细胞专用腺病毒 （Ads ） 一些特殊要点列举如下： 一、悬浮细胞专用腺病毒 （Ads ）实验策略与关键知识点 1.悬浮细胞专用： 汉恒生物开发的悬浮细胞专用腺病毒针对悬浮细胞的细胞膜特性进行了腺病毒的改造，病 毒感染体系也进行了相应的优化，极大改善对悬浮细胞的感染能力。对贴壁细胞的感染能力无影 响，可以通用 （感染贴壁细胞请参考“汉恒腺病毒操作手册”）。 2. 超强感染效率 汉恒悬浮细胞专用腺病毒对Jurkat 、K562 等众多悬浮培养细胞系感染效率接近100%，对血 液来源原代细胞，如CD4+ T 细胞感染效率可达60% 以上。 3.腺病毒的细胞感染特性： 1）腺病毒不插入细胞基因组，不形成稳定转染； 2 ）腺病毒的瞬时表达能力一般为2-4 周，细胞增殖越快，表达时间越短； 3 ）由于不会随机插入损伤基因组，相比较慢病毒，腺病毒对体外培养的目的细胞毒性较小， 因此可以用较高MOI 来感染目的细胞。 4 ）高滴度：汉恒生物提供的腺病毒产品滴度较高，由于采用了汉恒特有的体系，用于细胞 感染级别的腺病毒一般可以达到 1010 PFU/ml 滴度。 4.腺病毒细胞实验策略： 由于腺病毒的非稳转性、低离体细胞毒性以及高滴度，应用腺病毒感染细胞的一般策略是： 先扩增足量的目的细胞，然后用腺病毒载体感染目的细胞，待目的基因表达后直接进行后续的细 胞功能性实验。一般不会用腺病毒先感染细胞后再对细胞进行二次扩增放大化培养。 5.悬浮细胞专用腺病毒感染实验相关知识点： 1）悬浮细胞准备：腺病毒建稳转细胞系前，请确保目的细胞状态良好、无支原体污染。 2 ）感染细胞最佳MOI 的测定：MOI （感染复数）是指每个细胞感染的病毒数。 腺病毒对于不同种类不同来源的细胞，其最适MOI 各有差别。对于悬浮细胞，腺病毒MOI 一般以30 、100、300、1000、2000 的比例递增进行梯度摸索，相比于贴壁细胞，悬浮细胞的腺 病毒MOI 需求更高，MOI 梯度摸索建议用96 孔板进行以节省病毒和细胞。 3 ）MOI 对应病毒体积的换算 （非常重要！） 感染时细胞数（一般以传代计数细胞数×2 计算）×MOI=病毒个数；则加入的病毒体积数= 病毒个数/病毒滴度。 4 4 比如第一天传代1×10 细胞到96 孔板一个孔，第二天长到2×10 细胞，按照MOI=500 计算， 4 7 10 需加入病毒总量为2×10 ×500= 1×10 个病毒粒子，按照腺病毒1×10 PFU/ml 的滴度，则加入的 7 10 -3 病毒体积数为(1×10 )/(1×10 PFU/ml)= 1×10 ml= 1 μl。 二、 悬浮细胞专用腺病毒感染细胞步骤： 1. 感染前准备 1) 按实验需要将悬浮细胞铺板（比如96 孔板）37℃ 培养过夜。细胞数以第2 天密度约40%～ 60%间为宜。 2) 从冰箱取出悬浮细胞专用腺病毒并在冰上缓腺融化，待完全融化后开始病毒感染实验。 2. 目的细胞的感染 吸去细胞原有培养基，加入新鲜培养基，选定MOI 值换算对应的病毒原液体积，并按体积 将病毒原液加入细胞中，摇匀。封好口，放入平角离心机后，低速（200g ）离心1-1.5h ，然后放 入37℃培养箱中继续积感染4 小时。 1）37℃培养箱中感染完毕后，弃去含病毒的培养液，更换新鲜培养基，继续37℃培养。 2 ）感染48 小时后，荧光显微镜检测GFP/RFP 等荧光表达效率。对于部分悬浮细胞，荧光表 达较慢，需待96 小时后才会有明显荧光 三、感染实例