第十一章 RNeasy_FFPE_Kit -FFPE样本中提取.pdfVIP

Sample Assay Technologies RNeasy FFPE Kit -FFPE样本中提取总RNA 2012年05月 李慧/Emily Li Sample Assay Technologies 溶液配置 1、DNase I stock solution 请勿打开DNase I管盖，用针头吸550 µL RNase-free water (1.5 mL管装中提 供)，注射入DNase I，并正反倒置混匀溶液。切勿涡旋震荡！ 视试验习惯和计划，将配置好的DNase I stock solution 分装至大小合适的 离心管或PCR管。保存于-20℃，可保证效期9个月。可在2-8℃ 保持效期6周。 不可反复冻融。因此建议分装后-20℃保存，尽量一次用完，如果不能一次用 完，请即保存于2-8℃，6周内用完。 2、Buffer RPE 加44 mL乙醇(96-100%) 至Buffer RPE中，每次使用前都摇匀。加过乙醇后， 建议贴标签注明。 miRNeasy FFPE Kit -FFPE样本中提取 miRNA和 RNA(2011年11月) 2 Sample Assay Technologies 去石蜡的方法 1、庚烷和甲醇： A. 加入500 µL 庚烷，涡旋震荡10 s，室温孵育10 min (15-25 ℃)； B. 加入25 µL 甲醇，涡旋震荡10 s，9,000 × g (11,000 rpm)离心2 min； C. 小心用枪头吸取上清，吸取上清时不要碰到沉淀物，并用小枪头小心吸掉残 留的庚烷/甲醇； D. 开盖将沉淀物暴露在室温下空气干燥5 min； E. 加入150 µL或240 µL (切片数量大于2时) Buffer PKD， 涡旋混匀； F. 加入10 µL 蛋白酶K，用枪头温和混匀 (反复吸打)； G. 56 ℃ 下孵育15 min， 80 ℃ 下孵育15 min (如果只有一个加热模块，那 么当56 ℃孵育完成后，取出样本置于室温，待加热模块达到80 ℃再进行下 一步孵育；确保孵育的时间，时间过长或过短都回造成更多的RNA片段化和 CT值偏低) miRNeasy FFPE Kit -FFPE样本中提取 miRNA和 RNA(2011年11月) 3 Sample Assay Technologies 2、二甲苯、二戊烯或CitriSolv （三选一） A. 加1 mL二甲苯、二戊烯或CitriSolv，涡旋震荡10 s，全速离心2min ； B. 小心用枪头吸取上清，吸取上清的时候不要碰到沉淀物； C. 在沉淀中加入1 mL乙醇(96-100%)，涡旋混匀，全速离心2min(乙醇的作用 是将样本中的二甲苯去除)； D. 小心用枪头吸取上清，吸取上清时不要碰到沉淀物，并用小枪头小心吸掉 残留的庚烷/甲醇； E. 开盖在室温下孵育(15-25℃，最高不要超过37℃)10 min，或者孵育至所有 残液挥发； F. 加入150 µL或240 µL (切片数量大于2时) Buffer PKD， 涡旋混匀； G. 加入10 µL 蛋白酶K，用枪头温和混匀 (反复吸打)； H. 56 ℃ 下孵育15 min， 80 ℃ 下孵育15 min (如果只有一个加热模块，那 么当56 ℃孵育完成后，取出样本置于室温，待加热模块达到80 ℃再进行 下一步孵育；确保孵育的时间，时间过长或过短都回造成更多的RNA片段化 和CT值偏低) miRNeasy FFPE Kit -FFPE样本中提取 miRNA和 RNA(2011年11月) 4 Sample Assay Technologies 3、melting A. 加入150 µL或240 µL (切片数量大于2时) Buffer PKD， 涡旋混匀； B. 55℃ 加热 3 min，涡旋震荡10 s，全速离心2min； C. 用枪头刺穿石蜡层，加入10 µL 蛋白酶K，用枪头温和混匀 (反复吸取打 出)； D. 56 ℃ 下孵育15 min， 80 ℃ 下孵育15 min (如果只有一个加热模块， 那么当