电子显微镜技术2011.9.20.ppt

激光扫描共焦显微镜 光镜显微镜与电子显微镜的比较 摘要 为什么要对电镜观察的样品进行处理和准备? 用什么样的方法和仪器对样品进行处理? 透射电镜样品观察的特殊性? 电子束对样品的损伤 样品组织厚-电子束难于透过 含有水分- 不宜抽真空 活细胞的主要成份:C, N, O, H-低反差 样品的制备  解决上述提及的问题: 细胞胞膜的稳定 – 固定(Fixation) 去处胞体内的水份 – 脱水(Dehydration) 硬化 – 包埋(Embedding) 确保电子束的穿透和成像- 修块, 超薄切片 (Trimming and sectioning) 提高反差 – 染色(Staining) 室温环境下的样品制备 取材 化学固定-- 细胞膜稳固化 GAD, OsO4, ... 脱水 Ethanol, Acetone（丙酮）, Propylene（环氧丙烷）oxide, ... 树脂包埋 Epon（环氧树脂）, Spurr, Lowicryls, LR, ... 树脂聚合 ---硬化 Heat or UV 修块和超薄切片 UM with glass or diamond knife 染色 –提高反差 Lead citrate柠檬酸铅, Uranyle acetate醋酸盐, ... 室温条件下的样品处理程序 第二节 制样前的准备工作 一、实验设计工作 二、实验器具和实验试剂的准备 三、实验动物或人体材料的准备 第二节 取 材 第三节 固 定 四、电镜制样中常用的固定剂 电镜样品制备常用的固定剂是戊二醛与四氧化锇（OSO4）。 1.戊二醛：是一种五碳醛，含有两个醛基。醛基与蛋白质及核酸的氨基反应，把蛋白质及核酸等交连起来，形成不可溶的网络。 优点：1.最好的蛋白质固定剂。也能保存细胞内一些酶的活性。2.也能固定糖原和核酸，微管，是保存细胞精细结构最有效的醛，弥补四氧化锇固定的不足。3.戊二醛的渗透速度比四氧化锇要快，且反应快4.适于进行超微细胞化学研究工作 常用浓度：1～4％，需用缓冲液配制 2.四氧化锇：又称锇酸，但它不是酸，而是强氧化剂。有强烈的刺激性气味，毒性很强，最好在通风橱内操作。 优点：1.较好的固定脂类，蛋白质，能较好地保存组织细胞的微细结构。2.四氧化锇电子密度高，能使被固定组织产生良好的反差3.对缓冲液的要求不高。 缺点：1.不能保护糖原，不能固定核酸，对微管的固定较差。2.四氧化锇渗透组织很慢，所以组织块要切的很小。3.不能保存酶的活性4.四氧化锇具有挥发性和对粘膜的毒性作用 五、影响固定效果的因素 第三节 漂洗与脱水 要求：1. 固定样品，每次固定完一定要充分漂洗干净。2.样品脱水要充分，但不可脱水过渡，两者都影响后续的工作，导致实验失败。 第三节 浸透与包埋 二、几种常用的包埋剂 3.低粘度Spurr树脂特点：组织块中渗透速度快，对组织结构保存好，常用于致密组织的浸透、包埋。易于切薄片，切片透明度好。 二、浸透与包埋的具体操作 2.包埋的一般过程： 第四节 修块与定位 样品修块机 修块 人手 (刀片) 用玻璃刀 修块 Trim a resin block with the Leica EM TRIM 修块法(Trimming): Trimming修块 用超薄切片机修块: 对树脂块整修 A trimmed resin block 对修整后的样品切片 定位: 半薄及超薄切片 Leica Ultracut UCT and Ultracut R 第五节 超薄切片 玻璃制刀机 制作玻璃刀 Gluing Trufs 烤板器 制刀方法: 平衡式的分法 1 strip = 400mm 1 square = 25mm 1 strip = 16 squares 16 - 1 = 15 squares 15 squares = 30 knives 刀锋的鉴定法 盛超薄切片水槽的制备 盛超薄切片水槽的制备 Glue(粘) a TRUF on to a knife using wax 用腊粘 Leica EM MP 染色机 Staining Leica EM STAIN 10个标准染色程序 工作时间:10h 工作温度+60度 可自设计染色程序 25个样品/次 低温条件下的样品制备 冷冻超薄切片法Freeze Sectioning 此技术起源于1950年. 于1970年后该技术有很大的发展, 至今已 經 广泛应用. 冷冻切片法主要用于: 观察细胞膜, 核