核酸的体外扩增1.ppt

核酸的体外扩增 1953年Ｗatson和Ｃrick提出了DNA双螺旋结构及其半保留复制模型； 1958年Meselson和Stahl用实验证实了DNA半保留复制模型； 70年代以来，人们采用两种思路去尝试建立基因的无性繁殖体系，一是基因克隆技术；另一种思路是体外扩增技术； 1976年，Chien分离出热稳定DNA聚合酶； 1985年，美国Cetus公司人类遗传研究室的年轻科学家Kary.B.Mullis发明了具有划时代意义的聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction, PCR），Saiki等首次应用PCR法成功地扩增了人?－珠蛋白的DNA，并应用于镰刀状红细胞贫血的产前诊断。 1986年Erlish分离并纯化了适用于PCR热稳定TaqDNA Polymerase，1988年获得专利。 1988年Saiki开始将耐热性TaqDNA聚合酶应用于PCR，整个反应只加一次酶即可，扩增特异性和效率都明显改善，使操作大为简化； 1989年被誉为“分子年”,列PCR为十余项发明之首，PCR爆炸年； 1993年，Mullis荣获诺贝尔化学奖。 聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR) 概念:PCR是近年来发展起来的一种体外扩增特异DNA片段的技术，它根据体内细胞分裂时DNA半保留复制机理，能快速、特异地在体外将目的DNA片段扩增数百万倍。 迅速获取大量的单一核酸片段，在分子生物学研究中有举足轻重的意义。 能通过试管内的数小时反应将特定的DNA片段扩增数百万倍。 PCR的基本原理 PCR是在试管中进行的DNA复制反应，基本原理是依据细胞内DNA复制的机理，以及体外DNA分子于不同温度下双链和单链可以互相转变的性质，人为地控制体外合成系统的温度，以促使双链DNA变成单链，单链DNA与人工合成的引物退火，然后耐热DNA聚合酶以dNTP为原料使引物沿着单链模板延伸为双链DNA。 PCR全过程每一步的转换是通过温度的改变来控制的。需要重复进行DNA模板解链、引物与模板DNA结合、DNA聚合酶催化新生DNA的合成，即高温变性、低温退火、中温延伸３个步骤构成PCR反应的一个循环，此循环的反复进行，就可使目的DNA得以迅速扩增。 PCR反应体系：耐热的Taq DNA聚合酶、化学合成的寡聚核苷酸引物(primer)、4种dNTP、以及合适的缓冲液体系。 DNA模板变性（DENATURE）：模板双链DNA?单链DNA，94℃ 退火(ANNEALING)： 引物＋单链DNA?杂交链，引物的Tm值 引物的延伸（ELONGATION）：温度至70 ℃左右， Taq DNA聚合酶以４种dNTP为原料，以目的DNA为模板，催化以引物３’末端为起点的5’→3’DNA链延伸反应，形成新生DNA链。 新合成的引物延伸链经过变性后又可作为下一轮循环反应的模板PCR，就是如此反复循环，使目的DNA得到高效快速扩增。 理论扩增率：2n指数递增（n为循环次数），扩增25～30个循环，目标DNA可增加109倍。 实际扩增率：（１＋Ｘ）n，X为PCR的实际扩增率，平均约为75%.由于引物和底物的消耗，Taq酶活力的下降等因素，扩增产物的增加，逐渐由指数形式变为线性形式，所以实际上进行30个循环后，扩增倍数一般可达106～107。以上“变性、退火、延伸 ”三部曲为PCR一轮循环。 二、PCR引物设计 引物决定PCR扩增产物的特异性和长度。PCR反应中需要两条引物，即5’端引物和3’端引物。 5’端引物与待扩增片段5’端上游的一小段 DNA序列相同，引导信息链的合成；3’端引物与待扩增片段3’端的一小段DNA序列互补，引导互补链的合成，扩增的就是这一对引物之间的双链DNA片段。 引物设计的基本要求 引物长度一般为15～30个核苷酸。过短影响PCR的特异性，过长会提高相应退火温度，使延伸温度超过TaqDNA聚合酶最适温度74℃,影响产物的生成。 引物的碱基尽可能随机，避免出现嘌呤、嘧啶碱基堆积现象。3’端不应有连续3个G和C。否则会使引物和模板错误配对。G+C含量一般占45％ -55％。3’端和5’端引物具有相似的Tm值,Tm值计算公式： Tm＝4(G+C)+ 2(A+T) 引物自身不应存在互补序列以避免折叠成发夹结构。引物的连续互补序列，一般不超过3bp。 两个引物之间不应存在互补序列，尤其应避免3’端的互补重叠。 引物与非特异扩增区的序列的同源性不超过70％，引物3’末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列，否则易导致非特异性扩增。 引物3’端碱基是引发延伸的起点，因此一定要与模板DNA配对。引物3’端最佳碱基选择是G和C，形成的碱基配对比较稳定。 引物与模板结合时，引物的5’端最多可以游离十几个碱基而不影