相分离免疫分析的研究进展论文.docVIP

　　相分离免疫分析的研究进展论文 【摘要】 相分离免疫分析通过开展快速的均相反应和简单的异相分离而兼具了均相免疫与异相免疫的优点，方法易于实现自动化。本文介绍了相分离免疫分析的基本原理，对相分离免疫分析载体、固定化方式、标记物、应用及发展方向进行了评述。引用文献60篇。 【关键词】 免疫分析，相分离，环境敏感，温度敏感，pH敏感，评述 1 引言 相分离免疫分析是指将抗原(Antigen, Ag)或抗体(Antibody, Ab)与某种特殊载体偶联（这种载体会随着外部环境的微小变化而产生沉淀与溶解的突变）.freelan等发表了第一篇研究论文2。 目前，相分离免疫分析方法已经得到越来越广泛的应用。以固定化Ag及标准Ag竞争性与标记Ab发生免疫反应的竞争法为例，其步骤如下：（1）将Ag固定到相分离载体上，标记物与Ab相连，调节外界环境，在载体为均相时固定化Ag、标准Ag、标记Ab混合反应；（2）改变外界环境，偶联有免疫复合物的载体沉淀；（3）离心，倾去上层清液，得到复合物沉淀；（4）调节外界环境，沉淀重新溶于缓冲溶液；（5） 改变环境使载体沉淀析出；（6）离心倾去上清液（4～6步是清洗沉淀步骤，其目的是为了清除非特异吸附的标记Ab和标准Ag）；（7）沉淀加入缓冲溶液或显色底物；（8）转移到比色皿或微孔板信号测定。其分析步骤如图1所示3。夹心型免疫分析只在第（1）步有所不同，是将Ab固定在相分离载体上，均相条件下固定化Ab、标准Ag、标记Ab混合反应，形成夹心型复合物。 本文对相分离免疫分析载体种类、Ag或Ab在载体上的固定化方式、相分离免疫分析的标记物类型、相分离免疫分析的应用等方面进行了系统评价。 图1 相分离免疫分析原理图（略） Fig.1 Schematic diagram of phase separation immunoassay 2 相分离免疫分析载体种类 免疫分析的载体通常为聚苯乙烯微孔板、磁性微球等，但相分离免疫分析的载体为环境敏感物质，并以环境敏感相分离高分子为主，这些高分子能够因环境如温度、pH、离子强度、电场、光等4的微小变化产生相应的沉淀与溶解突变，其中用于相分离免疫的以温度敏感高分子和pH敏感高分子最为常见。 2.1 温度敏感相分离高分子载体 温度敏感相分离高分子是指针对外界温度的细微变化，能够产生沉淀与溶解突变的一类高分子。聚（N异丙基丙烯酰胺， polyNisopropylacrylamide, PNIP)是一种应用最为广泛的温度敏感高分子类载体，其水溶液在31 ℃左右发生相变，又称临界溶解温度(Ｌoperature, LCST)。温度高于LCST时，PNIP沉淀；低于LCST时，PNIP溶解。文献5报道，PNIP之所以出现温度敏感的特性，是因为低温时，PNIP 的亲水基与水形成氢键，导致高分子溶解，随温度升高，氢键减弱，高分子链内部的疏水基通过疏水作用互相缔合，高分子便沉淀出来。最初的相分离免疫分析研究均以PNIP作为载体6～11，直到1998年才出现新型载体的报道12。 免疫反应一般要求在生理温度37 ℃附近最为适宜13，但以PNIP为载体，反应温度必须低于31 ℃，这样会不可避免地影响反应速率和效率。林鹏等14曾将N异丙基丙烯酰胺（Nisopropylacrylamide, NIP）与丙烯酰胺（Ａcrylamide, AA）共聚，合成了另一种温度敏感高分子P(NIPAA)，有效提高了LCST，使得免疫反应能够在31 ℃以上进行。 2.2 pH敏感相分离高分子载体 通过改变温度敏感高分子LCST的方法只能部分提高免疫反应温度，仍旧不能在生理温度进行免疫反应。沉淀温度过高，易使Ag或Ab受到不同程度的破坏，应用pH敏感相分离高分子可以从根本上解决高温对Ag或Ab的破坏问题，该类高分子能对外界pH的细微变化做出响应，并产生相应的沉淀与溶解突变。与温度敏感高分子相比，pH敏感高分子具有以下优点：（1）可以在37 ℃进行免疫反应，从而进一步提高免疫反应的速度和效率；（2）制备方法多，可以根据不同的免疫体系制备不同的高分子；（3）本身带有可标记基团，易于Ag或Ab的固定化。因此，pH敏感高分子在相分离免疫分析中有着更好的应用前景。 周平等12合成了两种pH敏感高分子材料：甲基丙烯酸甲酯(Ｍethylmethacrylate, MMA)和丙烯酸(Ａcrylic acid, ACA）的共聚物P(MMAACA)以及甲基丙烯酸(Ｍethacrylic acid, MAA)和AA的共聚物P(MAAAA)，其发生相转变的pH值又称临界溶解pH（Ｌoethacrylate, BMA)，发现其LCSP增加到了pH 6.018。这两种高分子材料均