益肾蠲湿合剂对肾小球系膜细胞增殖及细胞外信号调节激酶激活的影响论文.docVIP

　　益肾蠲湿合剂对肾小球系膜细胞增殖及细胞外信号调节激酶激活的影响论文 孙影， 张雪鹏， 张健， 杨方 【摘要】 目的观察益肾蠲湿合剂对肾小球系膜细胞(glomerular mesangial cell, GMC)增殖及细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinases, ERK)磷酸化的抑制作用。方法将含低、中、高剂量益肾蠲湿合剂的药物血清作用于10%血清-DMEM培养液培养的GMC, 分别用MTT 和C增殖有明显的抑制作用，并随着剂量的增加作用也逐渐增强。细胞总ERK在各组间无明显差别。但不同浓度的益肾蠲湿合剂均显著地抑制血清所诱导的ERK1/2的磷酸化。结论益肾蠲湿合剂可通过抑制ERK1/2的磷酸化抑制GMC的增殖。 【关键词】 益肾蠲湿合剂；肾小球系膜细胞； 增殖； 细胞外信号调节激酶 Abstract：ObjectiveTo observe the effect of “Yishenjuanshi” on the proliferation of glomerular mesangial cells (GMCs) and the phosphorylation of extracellular signal-regulated kinases (ERK). MethodsAll herbs in “Yishenjuanshi” mixture ent, serum from rats eye blood free medium for 48hs and then 10% FSC-DMEM including “Yishenjuanshi” to detect GMCs proliferation and expression of phosphorylated ERK (p-ERK) by MTT and C proliferation ents arkedly inhibited p-ERK expression stimulated by FCS.Conclusion “Yishenjuanshi” treatment inhibits GMC proliferation via blocking ERK phosphorylation. Key ixture; Glomerular mesangial cell; Proliferation; ERK 复方益肾蠲湿合剂是华北煤炭医学院张健教授在多年临床和实验研究的基础上，拟定的治疗各型慢性肾炎的基本方药。本方直接针对慢性肾炎基本发病机理，重用黄芪，辅以枸杞、猪苓等药物.freelerular mesangial cell, GMC)的过度增殖［3］，为此本研究将观察益肾蠲湿合剂对GMC增殖的抑制作用，并进一步探讨其作用机理，从细胞和分子生物学方面探讨其防治肾小球硬化的作用机制。 1 材料与仪器 1.1 益肾蠲湿合剂水煎液由华北煤炭医学院中西医结合医院提供。 1.2 细胞大鼠肾小球系膜细胞(HBZY1)由武汉大学中国典型培养物保藏中心提供。 1.3 仪器及试剂超净工作台(美国 Forma scientific pany)；倒置显微镜(日本Nikon公司)；CO2 恒温培养箱(美国 Forma scientific pany)；四甲基偶氮唑盐(MTT，Sigma公司产品)；抗体（p-ERK1/2和t-ERK1/2）（美国 Cell Signaling）。 2 方法 2.1 含药血清的制备［4］将大鼠随机分为4组，即对照组，低、中、高剂量的益肾蠲湿合剂组。对照组给予等体积的生理盐水，益肾蠲湿合剂以临床成人日用量的10倍作为中剂量，20倍和5倍分别作为高剂量和低剂量。灌胃给药连续7 d，第7天重复给药两次，间隔时间2 h，并于末次给药后1 h后，眼球取血，无菌条件下分离血清，置56℃水浴30 min灭活抗体，再经0.2 μm滤膜过滤除菌，-20℃保存。 2.2 细胞增殖的测定检测采用四唑盐(MTT)比色法。GMC传代后，制成密度为1.5×104/ml的细胞悬液，加入96孔板内．每孔200 μl，置37℃，5% CO2培养箱中孵育24 h，吸弃上清液，加入无血清培养液200 μl。继续培养48 h，使绝大部分细胞处于同步（G0期）。弃上清液，分别加入DMEM 培养液（160 μl）、血清（20 μl）及低、中、高剂量的含药血清（20 μl），每组设5个复孔，分别于培养24，48和72 h时取出培养板加入MTT 20 ul(5 mg/m1)，继续培养4 h，吸弃各孔培养液，加入100 μl DMSO，室温避光，轻轻振荡10 min，使结晶充分溶解后，酶标仪490 nm波长处读取OD值。 2.3