白细胞介素1B基因多态性、幽门螺杆菌感染与胃癌发生的相关性论文.docVIP

　　白细胞介素1B基因多态性、幽门螺杆菌感染与胃癌发生的相关性论文 廖爱军，苏琦，田锋，姚育红，曾斌 【摘要】 目的 探讨湖南衡阳地区白细胞介素1B（IL1B）基因多态性与胃癌的关系以及幽门螺杆菌（Helicobacter pylori,HP）感染后胃癌发生的易感基因型。方法 52例胃癌患者癌旁正常胃粘膜组织和55例慢性胃炎患者胃粘膜组织，均经快速尿素酶和PCR检测HP，应用聚合酶链反应—限制性片段长度多态性（PCRRFLP）分析技术，进行基因型检测.freel)分为2块，1块行快速尿素酶检测HP,1块切成米粒大小置于-80℃冰箱冻存。实验组及对照组患者均来自于湖南衡阳地区。 对照组：70例标本来自本院胃镜室活检组织，无系统性红斑狼疮、炎性肠病、类风湿性关节炎和胃癌家族史，术前2周未口服抗生素治疗,病理确诊为慢性浅表性胃炎。取胃窦粘膜组织2块，1块行快速尿素酶检测HP，1块置于-80℃冰箱冻存。 1.2 实验方法 1.2.1 基因组DNA的提取 实验组胃窦部癌旁正常粘膜组织和对照组胃窦部粘膜组织，各取米粒大小一块，分别放入无菌EP管中用无菌眼科剪剪碎，按照上海生工DNA抽提试剂盒要求操作，DNA提取后于-20℃冰箱中保存。 1.2.2 HP的检测 （1）快速尿素酶法检测HP 试剂盒由福建三强公司提供，按试剂盒要求操作，加入组织样本后5min内颜色逐渐变红为阳性，不变色则为阴性。 （2）PCR检测幽门螺杆菌(HP) UreA基因 试剂盒由上海生工提供，引物参照文献1由上海生工合成，上游：5’GCCAATGGTAAATTAGTT3’；下游：5’CTCCTTAATTGTTTTTAC3’；扩增出的UreA基因片段长度为411bp。反应体系为25μl，包括PCR Master 12.5μl，上、下游引物各1μl，模板DNA1μl,去离子水9.5μl。反应条件为94℃ 5min 1个循环；94℃ 1min，47℃ 1min，72℃ 1min，35个循环；72℃延伸10min。产物于2%的琼脂糖凝胶（溴化乙锭染色）电泳，100V恒压30min，紫外灯下观察结果。出现411bp橙色条带的为HP阳性，无条带则为阴性，见图1。 (3)诊断标准及检测结果 所有标本经两种方法检测HP，两种方法同为阳性则为HP阳性，同为阴性则为HP阴性，一阳一阴者剔除。最后测出实验组标本52例，对照组标本55例。 1.2.3 基因多态性检测 (1)IL1B31和IL1B511位点PCR扩增 引物由上海生工合成，序列为：IL1B31上游：5＇ M：100bpDNA marker；14：HP阳性结果；5：阴性结果 图1 HPUeaA基因检测结果照片 AGAAGCTTCCACCAATACTC3’下游：5’AGCACCTAGTTGTAAGGAAG 3’。IL1B511 上游：5’TGGCATTGATCTGGTTCATC 3’下游：5’GTTTAGGAATCTTCCCACTT 3’。扩增体系均为25μl，包括PCR Master 12.5μl，上、下游引物各1μl，模板DNA 1μl,去离子水9.5μl。反应条件为94℃ 5min 1个循环；94℃ 30s，57℃ 40s ，72℃ 45s，35个循环；72℃延伸10min。产物于2%的琼脂糖凝胶（溴化乙锭染色）电泳，100V恒压30min，紫外灯下观察结果。 (2)PCR扩增产物的限制性内切酶消化 酶切体系为20μl，其中内切酶0.5μl，PCR产物5μl，缓冲液2μl ，去离子水12.5μl，37℃水浴4h。琼脂糖凝胶电泳及结果判定：3%的琼脂糖凝胶（溴化乙锭染色）电泳，100V恒压50min，紫外灯下观察结果。IL1B31位点存在C→T的基因多态性现象，为Alu I 酶切位点，基因型31C/C不被切开，只有239个为一个片段；31C/T产生239bp、137bp和102bp三个片段；31T/T产生137bp和102bp两个片段，见图2。IL1B511位点也存在C→T的基因多态性现象，为Ava I 酶切位点，基因511C/C酶切后产生190bp和115bp两个片段；511C/T产生305bp、190bp和115bp三个片段；511T/T产生305bp一个片段，见图3。 1.2.4 C→T突变和RFLP分析的可靠性证实 随机挑选电泳图上显示的两种不同纯合子基因型的PCR产物送上海生工进行直接测序，见图4～7。 1.3 统计方法 采用SPSS11.0软件建立数据库，先计算各组各位点基因频率以及等位基因频率，在符合Hardy：100bpDNA marker；1：C/C型；2：T/T型；3：C/T型 图 2 IL1B31基因多态性电泳图