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　　生长及凋亡作用的实验研究论文 肖柳英，洪暉菁，潘竞锵，吕俊华，沈文娟 【摘要】 目的利用血清药理学的方法，观察荔枝核含药血清体外的抑制肿瘤细胞生长；并研究荔枝核对小鼠S180，EAC体内、外细胞生长及凋亡作用。方法小鼠 S180，EAC细胞混悬液用生理盐水按1:1进行稀释制成含瘤腹水混悬液,在给药前24 h,每只小鼠腋窝皮下接种0.2 ml。荔枝核水提液对小鼠S180.freelo fora美国）；AIR TECH型医用超净台（苏净集团安泰公司）；XSZ-D型倒置生物显微镜(重庆光学仪器厂)；荧光显微镜（Olympus Japan）；BIO-RAD-450型酶标定量测试仪（美国）；流式细胞仪（FACSCalibur型Becton Dickinson）；BIO-RAD 电泳仪（美国）；Eppendorf 低温高速冷冻离心机（德国）。 1.3 试药荔枝核提取物：颗粒（颗粒∶生药＝1∶10），广东一方制药业有限公司；批号（0604229）。 环磷酰胺（CTX）：江苏恒瑞医药股份有限公司，批号 RPIM 1640培养液（GIBCO公司产品），批号1285082；青霉素、链霉素（广州白云山天心制药股份有限公司）；新生牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司产品），批号060704；胰蛋白酶（DIFICO公司生产）；四甲基偶氮唑盐（MTT，SIGMA公司产品）；二甲基亚砜（DMSO；美国Amresco公司产品）；Hochest33258(碧云天生物技术公司)；PI染料 sigma；细胞裂解液(碧云天生物技术公司)； BAX抗体（cell signaling）； BCL-2抗体（santa cruz）；GAPDH抗体（Chemicon）；ECL发光液；pierce 批号：HI106361 ；丙烯酰胺 sigma ; 甲叉丙烯酰胺 sigma ；SDS-十二烷基磺酸钠sigma；甘氨酸 Biorad；TAN滤纸 an。 2 方法 2.1 实验技术路线 2.1.1 离体细胞实验 2.1.2 在体动物实验 2.2 含药血清的制备按李仪奎等［5］方法制备含药血清：将体重约1.5 kg的健康雄性新西兰大白兔10只随机分为荔枝核颗粒剂高、中、低剂量组和环磷酰胺（阳性对照）组，另设生理盐水（空白对照）组，共5组，每组2只。荔枝核颗粒剂高、中、低剂量组给药剂量分别为168，84，42 g·kg-1·d-1，环磷酰胺组给药剂量为42.4 g·kg-1·d-1，空白对照组给予等体积生理盐水。各组动物每天灌胃给药或生理盐水，2次/d，每次间隔12 h，灌药前4h禁食不禁水，连续3 d，末次灌胃1 h后，3%戊巴比妥钠麻醉，颈动脉采血，4℃下静置4 h，3 000 r·min-1离心15 min，无菌分离血清经56℃，30 min灭活处理后，0.20 μm微孔滤膜过滤除菌，置－20℃保存备用。 2.3 MTT法检测含药血清对 HepG2细胞的抑制率取对数生长期的细胞HepG2细胞，以3×104 ml-1的细胞浓度在96孔板上每孔接种100 μl，让细胞贴壁生长24 h后，以不同浓度组含药血清体积比分别为10%，20%，30%作用于细胞，每组浓度设4个复孔，培养72h后分别测细胞的生长抑制率，重复3次取平均值采用,结果见图1;实验结果表明：荔枝核提取物30%含药血清高、中剂量和20%含药血清高剂量对HepG2肿瘤细胞具有明显的抑瘤作用。 2.4 Hochest33258染色检测细胞凋亡将无菌的铺有多聚赖氨酸盖玻片置于六孔板内，以4×105 ml-1细胞接种24 h后， 加入含药血清作用72h后，吸尽培养液，加入0.5 ml的固定液，固定10 min后，去固定液，用PBS洗3遍，5 min/次，加入0.5 ml Hochest33258染色液，染色5 min，边晃动边染色。抗淬灭液封片后，置荧光显微镜下观察，拍片；结果见表1；实验结果表明：其抑瘤作用机理可能与促进肿瘤细胞凋亡有关，如图1可见，Hochest染色肿瘤细胞出现凋亡形态。 表1 荔枝核提取物含药血清作用HepG2细胞72h的OD值(略) 2.5 流式细胞仪测定凋亡率取对数生长期的HepG2细胞，以4×105 ml-1到25 ml玻璃培养瓶，待其贴壁生长24 h后，加药72 h后，胰酶消化，收集细胞，制成单细胞悬液，用冷PBS洗涤两次，将细胞重悬于70%的冰乙醇固定24 h，离心弃乙醇，PBS洗涤1次，滴加已配好的200μl·ml-1 Rnase 0.5 ml，放置4 h以上，离心弃上清液，PBS洗涤1次，加0.5ml碘化丙锭（PI），过夜，离心弃PI，再用PBS洗涤1次，立即上机；结果见图2和表2; 而流式细胞仪检测可见30%含药血清高中低剂量的促肿瘤凋亡率分别是6