牙龈卟啉单胞菌菌毛蛋白fimA基因在大肠杆菌中的融合表达和纯化（三）论文.docVIP

　　牙龈卟啉单胞菌菌毛蛋白fimA基因在大肠杆菌中的融合表达和纯化（三）论文 本实验表达的His-FimA融合蛋白主要用于后续实验获得免疫血清和多克隆抗体，因此需求量较大，而且不用考虑靶蛋白是否具有活性。本实验所表达的His-FimA融合蛋白主要位于包涵体中，这种以包涵体形式表达的蛋白很稳定，不易被降解。这样在下一步实验纯化FimA蛋白时，可以在变性条件（使用变性剂8M尿素或者6M的胍盐酸）下溶解包涵体，以便于使用Co2+柱亲和层析得到纯化的靶蛋白。 本实验所使用的大肠杆菌BL21(DE3)pLysS所带pLysS具有氯霉素抗性。在将重组质粒和空质粒转化入宿主菌时，不需要使用IPTG进行蓝白筛选.freelA基因的原核表达质粒pET-15b-fimA，在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中诱导表达后，fimA基因得到正确表达。 4 实验二 FimA蛋白的纯化与鉴定 4.1 实验材料与仪器 4.1.1 菌珠 携带有pET-15b Vector和pET-15b-fimA的大肠杆菌BL21(DE3)pLysS：实验一获得。 4.1.2 主要试剂 1）BCA法蛋白定量试剂盒：碧云天公司 2）TALON纯化试剂盒：Clontech Laboratories,Inc,USA 3）其他：同实验一 4.1.3 实验仪器 1）宝特ELX-800酶标仪：宝特仪器有限公司 2）其他：同实验一 4.2 实验方法 4.2.1 样品制备 按照TALON纯化试剂盒操作说明书制备样品，步骤如下： 1）在转化了质粒pET-15b-fimA的LB固体培养基上，用接种环挑取阳性克隆菌落，接种于5 ml Amp+(100 μg/ml)的LB培养液中，37℃振摇过夜。 2）将5 ml过夜菌转接于500 ml LB(Amp+)培养液中，37℃振摇4 h；加入IPTG致终浓度为2 mmol/L ，37℃振摇3 h。 3）4℃，5500 r/min离心20 min收集细菌沉淀，弃上清，沉淀置于冰上或－20℃保存。 4）用Buffer A（pH 7.0）重悬细胞沉淀物，每25 ml细胞培养物使用2 ml缓冲液。 5）轻轻振荡样品直到它变得半透明为止。 6）4℃，10000～12000 r/min离心20 min以去除不溶性杂质。 7）小心的转移上清液到一个干净的离心管，不要触动沉淀物。离心管中的澄清的上清液就是样品了。 4.2.2 分批/重力流柱子纯化FimA蛋白 按照TALON纯化试剂盒操作说明书进行，步骤如下： 1）彻底重悬TALON树脂。 2）快速转移3 ml树脂悬液入一个无菌的离心管，700 g离心2 min，弃上清。 3） 加入10倍柱床体积的Buffer A（pH 7.0），小心混匀以平衡树脂，700 g离心2 min，弃上清。 4）重复步骤3。 5）加入4.2.1所制备的样品。 6）室温下，小心搅拌上一步所得混合液20 min，700 g离心5 min。 7）小心移除尽可能多的上清液，注意不要触碰到沉淀在离心管底的树脂。 8）用10～20柱床体积的Buffer A（pH 7.0）冲洗树脂。室温下，小心搅拌悬液10 min，以达到更彻底的冲洗效果，700 g离心5 min，弃上清。 9）重复步骤8。 10）加入1倍柱床体积的Buffer A（pH 7.0），重悬混合。 11）转移树脂到一个2 ml的重力流层析柱中，缓冲液从层析柱底部引流出来直至到达柱床顶部，该过程中要确保树脂柱床中不能有气泡进入。 12）用五倍柱床体积的加入了8 mM的咪唑的Buffer A（pH 7.0）冲洗柱子。 13）加入5倍柱床体积的Buffer B洗脱，按每500 μl一份来收集洗脱产物。 14）用SDS的分析结果来确定哪一份洗脱产物中含有目的蛋白。 15）将含有纯化蛋白的洗脱液以Buffer C稀释后，置于透析袋中，在4℃搅拌条件下，梯度透析： 4 M尿素→2 M尿素→1×PBS＋1 M NaCL→ l ×PBS+0.5 M NaCL →1 ×PBS →0.5×PBS→ddH20 16）将透析好的蛋白质留出20 μl用于蛋白含量测定，其余蛋白质冻干后做好标记置于－70℃保存。 Buffer A（pH 7.0）： 50 mM Na3PO4 , , nbsp; 8 M Urea(尿素) 300 mM NaCl Buffer B（pH 7.0）： 45 mM Na3PO4 7.2 M Urea(尿素) 270 mM NaCl 150 mM 咪唑 Buffer C（pH7.0）： 100 mM NaH2PO4 10 mM Tris-Cl 8 M Urea(尿素)