热休克蛋白70重组腺病毒载体的构建及鉴定论文.docVIP

　　热休克蛋白70重组腺病毒载体的构建及鉴定论文 【摘要】 目的 构建人热休克蛋白70(HSP70)的腺病毒表达载体，为进一步研究HSP70对应激状态下细胞的保护作用提供实验基础。方法 采用AdEasy系统构建携带外源性HSP70编码基因的重组腺病毒载体pAdHSP70，脂质体法转染人胚肾293细胞，包装产生重组腺病毒vAdvHSP。收获病毒进行滴度鉴定， RTPCR方法检测目的基因在Hela细胞的转录表达。结果 PCR、序列测定以及限制性酶切证实HSP70基因正确插入腺病毒表达载体，并在HEK293细胞中包装出重组腺病毒；荧光显微镜下可观察到GFP的表达，收获病毒的滴度为3.2×1012 U/L。结论 成功构建pAdHSP70重组腺病毒表达载体，且重组腺病毒在Hela细胞能有效转录。 【关键词】 HSP70热休克蛋白质类 腺病毒科 遗传载体 ［ABSTRACT］ Objective To construct rebinant adenovirus expression vector containning human HSP70 and provide a base for investigating the protection of HSP70 on the cellunder stringent state. Methods The rebinant adenovirus vector pAdHSP70 carrying HSP70 and then transfected 293 cells to produce rebinant adenovirus vAdHSP70. The viral titer ed by PCR, sequencing identification and restrictive analysis that the target gene id. The expression of GFP could be observed by fluorescence microscope. The viral titer ega公司，限制性核酸内切酶PacⅠ和PmeⅠ为英国NEB公司产品；DNA Marker、限制性内切酶EcoRⅤ和KpnⅠ、T4 DNA连接酶、pMD18T载体为大连宝生物工程公司产品；TRIzol购自美国Invitrogen公司。携带GFP报告基因的腺病毒穿梭质粒pAdTrackCMV，E1区和E3区缺失的复制缺陷5型腺病毒骨架质粒pAdEasy1，大肠杆菌JM109、BJ5183和 DH10B以及人宫颈癌细胞系Hela和人胚肾293细胞均由青岛大学医学院微生物学教研室提供。 1.2 实验方法 1.2.1 RNA提取及逆转录合成cDNA Hela细胞用含体积分数0.10的胎牛血清、105 μg/L 链霉素、105 U/L青霉素的DMEM于37 ℃、体积分数0.05的CO2培养箱内培养。当细胞达80%汇合后，42 ℃水浴30 min，然后迅速放回培养箱中继续培养8 h，胰蛋白酶消化离心收集细胞，采用TRIzol一步法提取细胞总RNA，按照逆转录试剂盒操作说明合成cDNA 。 1.2.2 目的基因的PCR扩增及TA克隆 根据GenBank中编码HSP70的核苷酸序列及pAdTrack CMV载体的多克隆位点，采用Primier 5.0软件设计扩增HSP70基因的特异性引物。并分别在两条引物中的5′端引入KpnⅠ和EcoRⅤ酶切位点以及保护性碱基。上游引物序列为：5′CGGGTACCCAACGACGGAGACAGCC3′，下游引物序列为：5′GCGATATCTCCAGCCACGAGATGACC3′，下划线部分为引入的酶切位点。引物由上海生工生物技术服务有限公司合成，扩增片段长度为1 486 bp。反应体系为：10×buffer 2.5 μL, MgCl2 1.5 mmol/L,dNTP 0.2 mmol/L,上下游引物各0.3 mmol/L，Taq 1 U, cDNA 2 μL，无菌去离子水补至25 μL。扩增条件为：94 ℃预变性5 min；然后94 ℃ 1 min，70 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，共35个循环； 最后72 ℃延伸10 min。取5 μL扩增产物于1 g/L的琼脂糖凝胶（含0.5 mg/L溴化乙锭）中电泳，凝胶自动成像系统分析结果。 自琼脂糖凝胶中回收纯化目的基因，然后与PMD18T载体在连接酶的作用下进行连接，将连接产物以1×TSS 两步法转化E.coli JM109，涂布于氨卞抗性的LB平板，37 ℃过夜培养。次日挑取平板克隆振荡培养后提取质粒，KpnⅠ和EcoRⅤ双酶切鉴定筛选阳性克隆，产物送上