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第三章 细胞生物学研究方法 STUDY METHODS OF CELL BIOLOGY 本章内容提要 细胞生物学研究方法多种多样,总的说来,可分为四个大类: 显微技术 细胞组分分析与原位检测技术 细胞培养与细胞工程 分子生物学技术 第一节 细胞形态结构的观察方法 显微镜是观察细胞的主要工具。 根据光源不同可分为: —、光学显微技术 1.显微镜的发明 300多年前 Leeuwenhoek 世界上最早的显微镜 2.光学显微镜构成： ①照明系统: ②光学放大系统: ③机械装置:镜座.镜柱等 4. 分辨力： D=0.61λ/N．A． 其中λ为入射光线波长；N．A＝ｎsinα/2，为镜口率 , n=介质折射率；α=镜口角（样品对物镜镜口的张角） 。 增加分辨率的二个必备条件: 增大镜口率---有一定限度 缩短波长---为可靠办法 普通光镜的最大分辨率为0.2μm, 大于0.2μm的结构为显微结构, 而小于0.2μm的称为亚显微结构. 几种介质的折射率 不同光线的波长 光学显微镜的几个光学特点： 制作光学镜头所用的玻璃折射率为1.65~1.78，所用介质的折射率越接近玻璃的越好。 sin α /2的最大值必然小于1；介质为空气，镜口率一般为0.05~0.95；其中低倍镜0.28，高倍镜0.65，油镜1.25，油镜头用香柏油为介质，镜口率可接近1.5。 普通光线的波长为400~700nm，分辨力数值不会小于0.2μm，人眼的分辨力为0.2mm, 因此光学显微镜的最大设计倍数为1000X。 （二）荧光显微镜 Fluorescence microscope 特点：光源为紫外线，波长较短，分辨力高于普通显微镜(0.1μm )； 有两个特殊的滤光片；可观察活细胞. 荧光显微镜的特殊用途: 用于观察能激发出荧光的结构 免疫荧光观察、基因定位、疾病诊断 细胞与组织中物质的吸收与运输 化学物质的分布与定位等 荧光现象有两种: 自发荧光（叶绿素） 诱发荧光（加荧光素） （三）激光共聚焦扫描显微镜 Laser confocal scanning microscope, LCSM 用激光作光源，逐点、逐行、逐面快速扫描。一束光线通过聚焦成点，在样品表面扫描后成象。它是一个扫描光学显微镜，因为在一个时间试样上只有一个点被照亮。随着试样被扫描，像素的积累便构成了图像。 因为物镜的焦平面很薄（只有0.5皮米）所以能够获得试样的真正光学断面。所有在焦平面以上或以下的图像数据都到不了探测器。随着焦平面的上升或者下降（Z轴），可以得到试样的分层图像并存储起来，这些分层图像就由计算机重构成三维图像。 分辨力是普通光学显微镜的3倍。 用途类似荧光显微镜，但能扫描不同层次，形成立体图像, 研究亚细胞结构与组分。 共聚焦? （四）暗视野显微镜 dark field microscope 聚光镜中央有挡光片，照明光线不直接进人物镜，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜，因而视野的背景是黑的，物体的边缘是亮的。 可观察 4~200nm的微粒子，分辨率比普通显微镜高50倍。 （五）相差显微镜phase contrast microscope 把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，明者更明，暗者更暗，立体感增强。从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。在构造上，相差显微镜有不同于普通光学显微镜的特殊之处: 物镜中加了涂有氟化镁的相位板，可将直射光或衍射光的相位推迟1/4λ.光源聚光器中增加一环形光阑。 用途：观察未经染色的标本和活细胞。 （六）微分干涉显微镜 Differential interference contrast microscope （DIC） （七）倒置显微镜 inverse microscope 物镜与照明系统颠倒，前者在载物台之下，后者在载物台之上，用于观察培养的活细胞，通常具有相差物镜，有的还具有荧光装置。 （八）当代显微镜的发展趋势 (九)荧光共振能量转移技术 荧光能量共振转移(fluorescence resonance energy transfer, FRET)是较早发展起来的一门技术，随着绿色荧光蛋白应用技术的发展，  荧光能量共振转移的结果：使得供体的荧光强度比它单独存在时要低的多（荧光猝灭），而受体发射的荧光却大大增强（敏化荧光）。 荧光能量共振转移技术的应用 FRET已经成为检测活体中生物大分子纳米级距离和纳米级距离变化的有力工具，在生物大分子相互作用分析、细胞生理研究、免疫分析等方面有着广泛的应用。 (十)荧光漂白恢复技术 flu