肝细胞生长因子的克隆、表达以及体内外的应用.pdfVIP

中文摘要 目的：本研究建立了一种非病毒型人肝细胞生长因子（Human hepatocyte [1] growth factor, HGF ）的基因治疗方式，避免病毒载体基因治疗所导致的副作用 。 通过定性及定量检测体外培养的人成纤维细胞中HGF 的表达及其体内应用，为 HGF 治疗脱发、促进毛发再生的临床应用提供一个前景良好的实验依据。方法： 克隆人的 hHGF 全长 cDNA 片段，插入 pTARGET 真核表达载体中，得到 pTARGET-HGF 质粒。采用脂质体lipofectamin2000 包裹重组质粒将其转染到体 外培养的人的皮肤成纤维细胞中（Human skin fibroblasts,HSF ）。由于本研究室之 前已经构建成功的pEGFP-N1-HGF 含有报告基因绿色荧光蛋白（GFP ），在荧光 显微镜下观察转染率具有直观性，所以在探索最佳细胞接种密度、DNA 浓度和 脂质体浓度等因素时，用 pEGFP-N1-HGF 得到的最佳转染率作为参考。采用蛋 白质印记方法（western blot ）、酶联免疫吸附测定法（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA ）分别进行HGF 蛋白表达的定性定量检测后，将其通过皮下注射应 用于小鼠体内，通过 HE 染色、免疫组化 （Immunofluorescence staining ）检测 HGF 在小鼠皮肤内的表达。结果：1. 质粒构建成功后，双酶切结果：经去内毒 素提取纯化质粒后，BamHI、SalI 进行双酶切、琼脂糖凝胶电泳进行鉴定后，可 得到5.67kb 和2.2kb 两个片段，与pTARGET 质粒的图谱相符，证明所得到的质 粒为重组子pTARGET-HGF 。 2.经传代培养的成纤维细胞在达到对数期的良好生 长状态，既 80% 的细胞达到融合后，转染目的质粒 pTARGET-HGF 、 pEGFP-N1-HGF ，在荧光显微镜下观测到经 pEGFP-N1-HGF 质粒转染后的细胞 5 发出绿色荧光，得到细胞接种密度为3.0×10 ，DNA 浓度为 0.8μg，脂质体用量 为 4.5 μL 时获得最高转染率，分别为 57.35 ± 1.29%、52.47 ± 1.26% 和 57.73±1.31% 。3. 体外转染细胞后，采用western blot 证明重组的pTARGET-HGF 基因在成纤维细胞中有所表达，同时提取转染后的细胞上清液，经 ELISA 鉴定 后检测到hHGF 在转染到人的皮肤成纤维细胞后可以分泌出hHGF ，其分泌量达 5 到 （5.76 ~ 10.74 ng/ 9×10 cells ）。将其用于体内后，发现实验组与对照组相比， 毛囊生长明显浓密，且经免疫组化检测到HGF 在皮肤中的表达。 结论：成功构建含有HGF 基因的真核载体pTARGET-HGF ，并将其应用于 体外试验中，检测到其表达及分泌后，再将其用于体内，发现小鼠的毛囊发育有 明显的改善。由此可证明HGF 具有生发的作用。 关键词：肝细胞生长因子； 转染；成纤维细胞；动物模型 ABSTRACT Objective: The aim of this study is to establish nonviral gene therapy of Human hepatocyte growth factor (hHGF) avoiding the viral vector-related side effects[1]. By detecting HGF expression in qual