XY10 03细胞破碎.pptVIP

概 述 一些微生物在代谢过程中将产物分泌到细胞外的液相中（称胞外酶），这些产品主要为医药和保健产品，如胰岛素、某些细胞因子和疫苗亚单位成分等。 这些蛋白质在细胞培养时被宿主细胞分泌到培养液中，提取过程只需直接采用过滤和离心进行固-液分离，然后将获得的澄清滤液再进一步纯化即可。其后续分离和纯化都相对简单。 但由于一些重组DNA（rDNA）产品结构复杂，必须在细胞内组装来获得生物活性，如果在培养时被宿主细胞分泌到培养液中，其生物活性往往有所改变，此类rDNA产品是细胞内产品（非分泌型），需要应用细胞破碎技术破碎细胞，使细胞内产物释放到液相中，然后再进行提纯，为后续的分离纯化做好准备工作。 概 述 胞外产品：各种胞外酶、胞外多糖、细胞代谢物 细胞本身：单细胞蛋白（SCP） 胞内产品：碱性磷酸酯酶，基因工程产物，植物细胞产物等 什么是细胞破碎技术？ 细胞破碎（cell rupture）技术是指利用外力破坏细胞膜和细胞壁，使细胞内容物包括目的产物成分释放出来的技术。 细胞破碎技术是分离纯化细胞内合成的非分泌型生化物质（产品）的基础。 随着重组DNA技术和组织培养技术上的重大进展，以前认为很难获得的蛋白质现在可以大规模生产。 第一节细胞的结构和破碎阻力 革兰氏阴性细菌的细胞壁 2、酵母菌的细胞壁 3、红面包霉菌(Neurospora crassa)的细胞壁 4、植物细胞壁的化学组成和结构 对于已生长结束的植物细胞壁可分为初生壁和次生壁两部分。 初生壁是细胞生长期形成的。 次生壁是细胞停止生长后，在初生壁内部形成的结构。 小结： 细菌：破碎的主要阻力来自于肽聚糖的网状结构，网状结构越致密，破碎的难度越大，革兰氏阴性细菌网状结构不及革兰氏阳性细菌的坚固； 酵母：葡聚糖的细纤维构成了细胞壁的刚性骨架，甘露聚糖形成网状结构，细胞壁破碎的阻力也主要决定于壁结构交联的紧密程度和它的厚度； 霉菌：细胞壁中含有几丁质或纤维素的纤维状结构，其强度比细菌和酵母菌的细胞壁有所提高； 植物细胞：次生壁的形成提高了细胞壁的坚硬性，使植物细胞具有很高的机械强度。 小结： 通常细胞壁较坚韧，细胞膜脆弱，易受渗透压冲击而破碎，因此细胞破碎的阻力主要来自于细胞壁。 基于遗传和环境等因素，不同类型生化物质其细胞壁的结构和组成不完全相同，故细胞壁的机械强度不同，细胞破碎的难易程度也就不同。此外，不同的生化物质其稳定性有较大差别，在破碎过程中应防止变性和被胞内的酶水解，因此，破碎方法的选择和操作条件的优化是十分必要的。 破碎方法 目前已发展了多种细胞破碎方法，以便适应不同用途和不同类型的细胞壁破碎。 破碎主要有三种方法： （1）化学破碎法 （2）机械破碎法 （3）化学和机械破碎法结合 化学破碎法 又称化学渗透法（chemical permeation) 原理：利用化学或生化试剂（酶）改变细胞壁或细胞膜的结构，增大胞内物质的溶解速率；或者完全溶解细胞壁，形成原生质体（protoplast）后，在渗透压作用下使细胞膜破裂而释放胞内物质。 机械破碎法 细胞所受的力：压缩力和剪切力。 细胞破碎仅为目标产物的释放创造了条件，而不是最终目的。 一、机械破碎 是工业规模细胞破碎的主要手段 主要基于对物料的挤压和剪切作用。 主要有高压匀浆、珠磨、撞击破碎和超声波破碎等 操作原理 细胞悬浮液在高压的作用下从阀座与阀之间的环隙高速喷出，每秒速度高达几百米，高速喷出的浆液又射到静止的撞击环上，被迫改变方向从出口管流出。细胞在这一系列高速运动过程中经历了剪切、碰撞及由高压到常压的变化，从而造成细胞破碎。 在操作方式上，可以采用单次通过匀浆器或多次循环通过等方式，也可连续操作。为了控制温度的升高，可在进口处用干冰调节温度，使出口温度调节在20℃左右。在工业规模的细胞破碎中，对于酵母等难破碎的及浓度高或处于生长静止期的细胞，常采用多次循环的操作方法。 高压匀浆法适用的范围 适用于微生物细胞和植物细胞的大规模破碎 料液细胞浓度可达到20%左右。 易造成堵塞的团状或丝状真菌，较小的革兰氏阳性菌，含有包含体的基因工程菌（因包含体坚硬，易损伤匀浆阀）不宜使用高压匀浆法。 高压匀浆法使用时注意事项 高压匀浆器的操作温度上升约２~３℃/10MPa 为了保护目标产物的生物活性，需要对料液作冷却处理。 多组破碎操作中需要在级间设置冷却装置可有效防止温度上升，保护产物活性 高压匀浆器的种类 高压匀浆器的种类较多 WAB公司的AVP Gaulin 31MR型，最大操作压力为24MPa，最大处理量为100L/h Bran and luebbe 公司SHL40型，最大操作压力为20-63MPa，最大处理量为为2.6-34 m3/h 影响破碎的主要因素 压力、温度、通过均浆器阀的次数 升高压力有利于破碎，它