作为肝癌的共同生物标志物进行鉴定剖析.PDFVIP

通过综合分泌蛋白质组和转录组分析对CHI3L1 和MASP2 作为肝癌的共同生物标志物进行鉴定 原发性肝细胞癌（HCC ）是排名第五位的最常见肿瘤，每年有超过50 万的 确诊新病例。需要发现新的肝癌标志物。通过串联质谱法分析 12 对肝癌和对应 癌旁组织的分泌蛋白质组，鉴定了1528 个蛋白，发现2 个的特殊肽。假阳性率 为3.4 ％。利用光谱计数发现HCC 组中有87 蛋白，正常组中有86 个蛋白表现出 五倍表达正常组。这些数据中很可能存在候选的生物标志物。我们采用了区分生 物标志物组合的新的参数，该参数包括上调的癌症生物标志物和下调器官富集的 分子标记，运用转录组和蛋白质组整合分析确定了几丁质酶3 样蛋白1（CHI3L1 ） 和甘露聚糖结合凝集素丝氨酸肽酶-2 （MASP2 ）是肝癌诊断的首选生物标志物组 合。 采用酶联免疫吸附测定法，进一步在25 例肝癌患者血清标本和15 例年龄匹 配的正常对照标本中对这种生物标志物进行评估。组合标记（YKL40/MASP2 比 值）作为肝癌诊断的表现比任何单独标记好，AUC 为 0.97 。在肝癌患者与疾病 对照组和独立的群体中对生物标志物对进一步验证是必要的。 原发性肝细胞癌（HCC ）在常见肿瘤中排第五，其导致的癌症相关死亡排第 三位，每年有超过50 万确诊为新发病例[ 1]。早期发现的肝癌是可以手术治愈的， 肝硬化患者通过生物标志物甲胎蛋白（AFP ）检测和每6 个月B 超检测早期肝癌 [ 2 ]。不幸的是，虽然AFP 被广泛用于诊断肝癌和监测[3,4] ，其假阴性或假阳 性率高达 40 ％ [5 ，6] 。直接将血清样本用于疾病的诊断和预后分析有几个关键 的优势，包括低侵袭，最低的成本，方便样品的采集和处理。 然而，由于血清蛋白质组的复杂性和至少为10 9 -10 10 巨大动态范围为[7]， 蛋白质组学直接分析本质上是具有挑战性的。我们从肝癌和健侧周围组织培养基 所采用的方法是（i ）分析分泌组（分泌蛋白），（ii ）分析肝癌与健侧周围组织的 转录组识别差异表达的基因，（iii ）综合转录组和分泌组分析，找出首选的血清 标志物，（IV ），使用酶联免疫吸附试验验证候选生物标志物，以及（v ）结合癌 症生物标志物与器官富集生物标志物以提高准确性诊断。使用上面的方法，我们 确定了生物标志物CHI3L1 和MASP2 组合进行肝癌诊断的AUC 为0.97 。 2. 实验材料和方法 2.1 临床样本收集 经过 IRB 的批准收集，肝癌和良性相邻配对组织（距离肝癌组织的边缘至   少为2 厘米）来自浙江大学附属第一医院接受肝切除或肝移植的 12 肝癌患者。 有 12 例的临床和病理资料汇总于表 1。这些患者手术前没有接受抗肿瘤治疗。 额外的血清样本来自于浙江大学附属第一医院血清库。 2.2 组织培养 成对的组织转移到含有20 毫升PBS 的培养皿中，并用剪刀剁碎成2-3-立方 毫米片段。此后，组织碎片再悬浮于50mL PBS 中，并经过不锈钢过滤器（200 毫米直径）以丢弃单一细胞和细胞碎片。所收集的组织用 PBS 洗涤三次，重悬 在20ml 无血清DMEM （Sigma 公司，圣路易斯，密苏里州）的培养皿中。该组 织碎块在细胞培养孵育箱（Thermo Scientific 的，Milford ，马萨诸塞州），用5 ％ CO2 中培养在37C 。 2.3 蛋白质组学样本的制备 在组织培养24 小时后收集上清液。将上清液离心20000g 10 分钟以除去可 能包含在上清液中的任何细胞或细胞碎片。SpeedVac 中（LABCONCO Centrivap 集中，堪萨斯城，密苏里州）对样品浓缩约20 倍，并重新悬浮于25 mM 的碳酸 氢铵（NH4 HCO3 ，Sigma 公司，圣路易斯，密苏里州）中。取60 毫克每个样   品，在12％SDS 聚丙烯酰胺凝胶上进行分离。凝胶用胶体CBB 染色。凝胶中的 蛋白质使用Pierce 凝胶内胰蛋白酶消化试剂盒（皮尔斯生物技术，罗克福德，IL ） 进行胰蛋白酶消化。 2.4 质谱分析 肽段混合物通过配备一个捕获柱（Dionex 公司/ LC 包装间柱前盒P/ N160454 C18 PepMap100，5 毫米分离 100 A ，300 毫米内径×5 毫米，桑尼维尔，CA ） 和纳米柱（戴安/ LC 包装P / N1603211506