血清乳酸脱氢酶测定.pptVIP

血清乳酸脱氢酶测定 实验目的 学习血清LDH同工酶的测定 学习血清LDH活性的测定 实验原理 来源于同一个体或组织，能催化同一反应，而蛋白 结构不同的酶称为同工酶(isoenzyme) 。同工酶的蛋白 结构、理化性质乃至免疫学性质不同的一组酶。因此可 用电泳或其它方法将它们分离开。 血清LDH同工酶的测定 乳酸脱氢酶（LDH）同工酶，它们都能催化乳酸脱氢产生丙酮酸，经电泳分离后有5个同工酶区带。LDH由2类亚基组成，单个亚基MW为35000,总分子量为140000。 人体心、肝和骨骼肌LDH同工酶谱 组织器官 LDH1 LDH2 LDH3 LDH4 LDH5 （ 占总 LDH活性的百分比） 心 35-70 28-45 2-16 0-6 0-5 肝 0-8 2-10 3-33 6-27 30-8 骨骼肌 1-10 4-18 8-38 9-36 40-97 正常血清 27.1±2.8 34.7±4.3 20.9±2.4 11.7±3.3 5.7±2.9 血清LDH活性的测定 原理 丙酮酸在碱性条件下和2、4-二硝基苯肼反应生成 的2、4-二硝基苯腙在碱性条件下呈棕色，颜色的深浅 和丙酮酸浓度成正比。然后与丙酮酸标准液比较，可 求得LDH活性单位。 操作 标准曲线的绘制 血清LDH活性的测定 单位定义 以100ml标本作用15min生成1μg分子丙酮酸为1单位。 参考值 血清100-300U/L 注意事项 LDH只作用于L－乳酸钠，只用L－乳酸钠用量减办； 草酸盐抑止LDH活力，不能用草酸钾作为抗凝剂的抗凝血来测定； 不能用溶血标本； 比色应该在5-15min内完成，否则A降低。 临床意义 LDH虽广泛存在于人体的各组织中。存在于几乎所有组织中，以肝、肾、心肌、骨骼肌、胰腺和肺中为最多。这些组织中的LDH的活力比血清中高1000倍。所以当少量组织坏死时，该酶即释放血而使其血液中的活力升高。测定此酶常用于对心梗、肝病和某些恶性肿瘤的辅助诊断。心脏以LDHl为主;而横纹肌以及肝脏、血小板以LDH5为主;肺、脾以LDH3为主，脑、肠、淋巴与内分泌腺也含有LDH 3。由于LDH同工酶分布有明显的组织特异性，故可根据这一特异性来协助诊断疾病。成年健康人LDH2LDHlLDH3 LDH4LDH5或LDH2LDH3LDHlLDH4LDH5。 * * EXPERIMENT 6 H H H H H H H M H H M M H M M M M M M M LDH1 (H4) LDH2 (H3M) LDH3 (H2M2) LDH4 (HM3) LDH5 (M4) 乳酸脱氢酶的同工酶 1 2 3 4 5 酶活性 迁移位置 酶活性 迁移位置 a b (a) LDH同工酶电泳图谱 (b) （a）正常人LDH同工酶电泳图谱 （b）心肌梗塞病人血清LDH同工酶电泳图谱 1 2 3 4 5 *生理及临床意义 在代谢调节上起着重要的作用； 用于解释发育过程中阶段特有的代谢特征； 同工酶谱的改变有助于对疾病的诊断； 同工酶可以作为遗传标志，用于遗传分析研究。 心肌梗死和肝病病人血清LDH同工酶谱的变化 1 酶活性 心肌梗死酶谱 正常酶谱 肝病酶谱 2 3 4 5 + NAD+ LDH + NADH?H+ NADH?H+ + PMS NAD+ + PMS?H2 + NBT PMS + NBT?H2 蓝色化合物 当 LDH 同工酶区带在琼脂糖凝胶板上分开后，给NAD+, 底物（乳酸）、PMS 和 NBT，同工酶区带即呈蓝紫色。 PMS?H2 1、制备0.5%琼脂糖凝胶板；2、上样12-15μl；3、120V、90min电泳；4、显色与保温；注：显色剂应临时配制并避光保存，保温也应避光进行。 二、操作步骤 溴酚蓝电泳指示剂 LDH5 1.4% LDH4 3.9% LDH3 18.5% LDH 2 42.8% LDH1 33.4% 量少肉眼观察不到 - + 点样孔(样品端接负极) 混匀，440nm比色，以空白管调0,读取各管A，以A对LDH单位作图，绘制标准曲线。 1250 1000 750 500 250 125