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紫外吸收法测定蛋白质/DNA浓度 用户指导书 北京普析通用仪器有限责任公司 应用技术部 2004年7月 目录 前言： 1 1．蛋白质/DNA浓度测定的意义 1 2．紫外吸收法测定蛋白质/DNA浓度的原理 1 2.1紫外吸收法测定蛋白质浓度的基本原理 1 2.2紫外吸收法测定DNA浓度的基本原理 2 3．紫外吸收法测定蛋白质/DNA浓度的方法 2 3.1 纯蛋白质浓度的测定方法 2 3.2 纯DNA浓度的测定方法 4 3.3 蛋白质/DNA混合溶液浓度的测定方法 5 4．UVWin5.0软件包测定蛋白质/DNA浓度的使用方法 7 4.1．启动DNA蛋白质测定功能 7 4.2．设置测量参数 8 4.3．处理测量结果 9 5．影响紫外吸收法测定蛋白质/DNA浓度的因素 9 6．测定蛋白质/DNA浓度的其他应用方法简介 11 前言： 本书将主要介绍紫外吸收法测定蛋白质/DNA浓度的原理、方法以及在测定过程中的一些影响因素，并对其他一些使用化学试剂测定蛋白质/DNA的方法进行了讨论，旨在对用户测定蛋白质/DNA时有一定的指导意义。 1．蛋白质/DNA浓度测定的意义 “21世纪是生物科学的世纪”！ 随着克隆羊的成功，随着人类基因组计划的实施和推进，生命科学研究已进入了后基因组时代。在这个时代，生命科学的主要研究对象是功能基因组学，包括结构基因组研究和蛋白质组研究等，而基因组学、蛋白质组学的最基本的研究单位就是蛋白质和DNA。因此，蛋白质测定法，生物化学研究中最常用、最基本的分析方法之一。238nm的光吸收值与其肽键含量成正比，从而与蛋白质溶液的浓度相关。 2.2紫外吸收法测定DNA浓度的基本原理 DNA也为生物大分子，所产生的紫外吸收也是其分子内的小基团所引起的，例如嘌呤碱、嘧啶碱等等。 嘌呤碱、嘧啶碱以及由它们参与组成的核苷核苷酸及核酸对紫外光都有强烈的吸收作用。它们吸收紫外光的共同特点是在260nm处为最大吸收值。280nm附近具有最大吸收，而且各种蛋白质的这三种氨基酸的含量差别不大，所以很多蛋白的浓度与A280成正比。 测定方法：测定蛋白质标准溶液在280nm处的吸收值A，以A对蛋白质标准溶液浓度作标准曲线，然后再测定待测样品在280nm处的吸收值A，通过标准曲线法计算出样品浓度。 方法的缺点： （1）干扰物质较多，高浓度的盐（如NaCI）、含有共轭双键的有机溶剂、核酸都会对测量结果产生干扰。因此本方法一般只适用于纯蛋白溶液（不含其他盐类或其他盐类浓度非常低）。 （2）目标蛋白与标准蛋白中所含上述三种氨基酸的含量差别较大时，测量结果将会产生大的偏差。 值得注意的是，目前该方法的应用已经非常广泛，很多蛋白在一定浓度和一定波长下的吸光度A值都有文献数据可查，因此将所测吸光度A值结合文献数据即可以计算出相应的蛋白质浓度。 2．肽键测定法（A238法） 蛋白质溶液在238nm处的光吸收的强弱，与肽键的多少成正比，故此法称为A238法。（有时也可以使用A230法取代） 测定方法：测定蛋白质标准溶液在238nm处的吸收值A，以A对蛋白质标准溶液浓度作标准曲线，然后再测定待测样品在238nm处的吸收值A，通过标准曲线法计算出样品浓度。 A238法比A280法灵敏，但多种有机物，如醇、酮、醛、醚、有机酸、酰胺类和过氧化物等都有干扰作用。所以最好用无机盐、无机碱或水溶液进行测定。若含有有机溶剂，可先将样品蒸干，或用其他方法除去干扰物质，然后用水、稀酸或稀碱溶解后再作测定。 3．215nm和225nm下的光吸收差法： 本方法为一个经验公式。 蛋白质的稀溶液由于含量低而不能使用280nm的光吸收测定时，可用215nm与225nm下的光吸收值之差，通过标准曲线法来测定蛋白质稀溶液的浓度。 吸收差(= A215 －A225 测定方法：测定蛋白质标准溶液在215nm和225nm处的吸收值，计算出吸收差(，以(对蛋白质标准溶液浓度作标准曲线，然后再测定待测样品在215nm和225nm处的吸收值，计算出吸收差(，通过标准曲线法计算出样品浓度。 在蛋白质浓度20~100(g/ml范围内，蛋白质浓度与吸光度差值成正比，其中NaCl、（NH4）2SO4以及0.1M磷酸、硼酸和Tris等缓冲液，都无显著干扰作用，但是0.1N NaOH, 0.1M乙酸、琥珀酸、邻苯二甲酸、巴比妥等缓冲液的215nm光吸收值较大，必须将其浓度降到0.005M以下才无显著影响。 3.2 纯DNA浓度的测定方法 DNA在260nm下有最大吸收，且A260值与DNA的浓度成正比例关系。因此，可以根据DNA溶液的A260值来计算DNA溶液的浓度。 测定方法：测定DNA标准溶液在260nm处的吸收值A，以A对DNA标准溶液浓度作标准曲线，然后再测定待测样品在260nm处的吸收值A，通过标准曲线法