实验五 酶切鉴定紫外分光光度检测DNA含量.pptVIP

1.1 影响DNA在凝胶中迁移速率的因素 DNA分子的大小 构象 凝胶浓度 电压 缓冲液 * 1. 重组质粒的酶切鉴定 2. 紫外分光光度法检测DNA含量 实验五 原理 在pH8.0（碱性）的环境中DNA的磷酸基团解离，使DNA在该环境中带负电荷，在电场中向正极方向泳动，因为各种DNA分子的电荷数、分子量、构象不同，它们在通过凝胶立体网格时所受的动力和阻力不同，所以泳动的速度有差异，以此达到分离的目的。 DNA显色剂多用EB，它能和碱基间的氢键结合，在紫外光照射下呈橘红色（530nm）的荧光。 * 1、酶切质粒DNA后的琼脂糖凝胶电泳 1.2 不同浓度琼脂糖的凝胶分离范围 琼脂糖浓度（％，W/ V ) DNA分子的有效分离范围（kb) 0.7 0.8-10 0.9 0.5-7 1.2 0.4-6 1.5 0.2-3 2.0 0.1-2 琼脂糖凝胶板的制备 （封板、制备1%凝胶、倒胶、插梳、凝固后拔梳） 倒缓冲液，加样 （取酶切质粒DNA样品液 20μl + 4 μl上样缓冲液，混匀 ） 电泳（100V 0.5小时，5V/cm） 染色与检测 （紫外灯下检测） 3 实验步骤 一、电泳前准备 实验记录备查 4.计算agarose的用量和制胶 buffer的用量记录，胶最终越薄越好。 达到较好的分离效果，防止样过快跑出胶或者是过慢浪费时间。 3.根据DNA的分离范围选择合适的胶浓度并记录 排除电泳槽的电极接触不良，确保buffer的缓冲能力，减少污染。 2.检查电泳槽，根据情况更换buffer 防止不必要的重复污染，减少外来的污染。梳子干净有利于梳孔的形成。 1.刷干净电泳制胶的梳子，板子，槽子，蒸馏水洗净晾干 作用 准备内容 二、制胶 缓缓地将梳子垂直从梳孔拔出，尽可能使梳子是同时从各个胶孔拔出的。暂时不用的胶最好放入电泳槽电泳液中浸泡。电泳液要浸没胶1mm。 5.拔梳子，放入电泳槽。 过程中不要碰到梳子，尽量保持胶的位置不移动。时间不宜过久，导致胶干燥变形；不宜过短，影响胶内部孔径形成。 4.室温凝胶30分钟 制胶的桌面相对水平。倒胶时尽量减少气泡的产生。EB如果在制胶时加入，在60度左右时加入，使终浓度为0.5ug/ml。不宜过低，染色成像不明显；不宜过高，导致背景太深。摇匀要沿着瓶壁摇动，尽量减少气泡产生的可能性。高浓度胶例如2%以上的EB很难摇匀，而且凝的速度也相对快，强烈建议跑完胶之后再用EB染色。 3.倒胶，可用水浴的办法使胶冷却到60度左右，即手可以握住瓶子的温度，沿着制胶板的一侧，缓缓地一次性倒入。梳子最好是预先放好并固定的，注意梳孔的体积能点的下所有的样。用枪头赶掉气泡。 非常热，小心烫手，另外注意不要加热过度使胶冲出瓶子。因此注意选择起码为胶体积2倍以上的瓶子。保证胶混匀和完全溶解，减少可能因此引起的胶中孔径不均匀影响分离效果。 2.融胶，加热到胶产生大量的气泡时，拿出摇匀，继续加热到完全溶解，拿出摇匀，再加热到沸腾。 Buffer不要用成H2O，称量相对准确 1.称量agarose和buffer 注意事项 步骤 三、上样电泳 胶孔与电极成水平状态，防止样品跑歪。跑胶期间不时回来看看，防止样品跑出胶等意外发生。 3.接通电源，选择合适的电压和时间电泳。 沿着胶孔的边缘匀速加入。尽量避免碰坏胶孔。枪头不要吸过多的气泡，拔起时不要过猛带出样品。每点一个样完，吸取buffer洗枪头，避免样品混杂。如果是有特殊要求，例如回收，强烈建议每点一个样换一次枪头。加样的速度当然是越快越好，注意保证质量。点样的量不要太大，一方面是体积不要太大，溢出污染邻位样品；一方面两不要太大，容易导致脱尾和模糊不清。 2.点样 Loading buffer浓度不宜过低，点样时样品不能很好的沉在胶孔里；不宜过高，电泳时容易形成带形的变形。注意混匀。 1.样品中加入loading buffer使其终浓度为1 X，混匀 注意事项 步骤 实验小结 思考 ①质粒构型对结果的影响？ ②酶切前后的对比？ * (1) 超螺旋DNA (supercoiled DNA, SC DNA) 1.2 质粒的三种构型