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正向遗传学技术的研究 生物技术1 8-13号 正向遗传学定义 正向遗传学在疾病基因克隆中的应用 存在的问题 正向遗传学(forward genetics) 传统的遗传学手段大致可以分为“正向遗传学”（forward genetics）和“反向遗传学”（reverse genetics）两类。 正向遗传学是指，通过生物个体或细胞的基因组的自发突变或人工诱变，寻找相关的表型或性状改变，然后从这些特定性状变化的个体或细胞中找到对应的突变基因，并揭示其功能。 简单地说，正向遗传学是从表型变化研究基因变化 正向遗传学的优点是可以通过突变现象来揭示基因功能。 　疾病基因克隆 　　通过基因定位可将某一疾病基因定位到某号染色体或某号染色体的某一区带(细胞遗传学概念,高分辨染色体技术可显出1 000 条带, 平均每条带约含300 ×104 个核苷酸, 约100～150 个基因) ,或某一区带的十几个或几个分摩内(分子遗传学概念, 人类染色体为3 300 分摩, 每个分摩约含90 ×104 核苷酸, 约30～50 个基因) 。然后采用各种分子遗传学和计算机相结合的方法, 将这个定位区内可能相关的基因分离出来, 再用这个基因对家系中的患者与正常者逐个进行基因检测。如果发现某一突变仅存在于患者中, 则可初步确定这个基因可能是导致这种病的疾病基因。最后, 再作相应病人或动物相关组织的基因表达, 若这个基因在这种组织中表达, 则可认为找到了该病的疾病基因。 基因定位 基因定位基本原理 在基因功能的研究中, 一般选择单基因控制隐性突变性状, 这是因为单基因控制质量性状, 可以最大限度的排除其他因素的影响, 从而更快速的把某个基因和某个性状联系在一起。 确定单基因控制隐性突变一般经过两个过程，一个叫做粗定位，之后进行精细定位。 粗定位的目的是将突变基因首先确定在某条染色体的某个区段。精细定位的目的是在粗定位的基础上,利用各种分子标记来把定位区间逐渐缩小, 最后缩小到一个范围( 国际上100kb 左右遍可以进行测序) , 最终通过基因测序的方法, 找到与野生型不同的突变位点, 从而将表型和基因连锁, 继而为进一步研究基因功能奠定基础。 粗定位 选取突变体材料, 作为基因池( 30 个突变体材 料的基因组放在一起提取DNA）。由于突变体材料突变位点的基因型为隐性纯合, 根据遗传连锁定律, 与该位点连锁紧密的位点交换率下降, 那么在基因池中, 大部分不会交换,即是基因池中呈现与突变株系一致性的分子标记, 是与突变位点相连锁的, 也就是距离突变位点最近的, 由此可以将突变位点确定在某一染色体的某个区段。 精细定位 精细定位, 则是单株取材, 总体上大约需要1000 株以上的单株。在粗定位的基础上, 在定位位点附近寻找大量分子标记。在与该粗定位连锁的情况下, 大部分的突变体, 在粗定位附近的分子标记上, 亦会呈现与突变株系相一致的特征, 但是还是会有少量突变体出现重组。根据重组的频率, 重组的方向, 可以判断, 分子标记突变位点的距离和方向, 逐渐将定位的区间缩小。 基因定位中存在的问题 粗定位中, 有时候会出现与两个以上的标记连锁, 这时候最好的方法是更换分子标记, 在连锁的标记附近寻找其他分子标记来代替, 因为很多分子标记都有可能出现某一株系的倾向性。在精细定位时会出现分子标记不够用的情况, 这就要发掘其他分子标记, 常用的分子标记有插入缺失分子标记、单碱基差异等等。 群体构建 由于物种的差异性和多样性, 构建基因定位遗传群体的限制因素也很多, 具体情况都有不同的解决方案, 这里讨论基本原理。 基因定位是根据基因组之间的差异性作为分子标记来进行基因定位的。要得到这种分子标记, 我们通常用两个基因组拥有差异的生态型作为基本材料, 诱变其中一个生态型, 另一个生态型作为基因组差异引入材料, 由此才能作为以交换为前提而产生的分子标记，如SNP（单核苷酸的多态性）、INDEL（插入缺失标记）等。 野生型A、野生型B, 已知它们在基因组上有各种差异存在。我们诱变野生型A, 确定要研究的表型后选取突变体∶野生型为1∶3 的突变株系, 利用生物统计学方法确定该比例的可信度, 一般统计数据应该大于200 个单株, 才具有一定的可信度。根据三大遗传定律，在性状分离比严格符合突变体∶野生型为1∶3 的情况时, 可以推测是单基因控制的隐性突变, 这对研究单基因的功能是非常有用的规则, 一般继续统计单株下一代的比例, 以验证。 假设野生型该基因位点表示为T, 突变后的隐性基因为t, 那么就可以假设野生型在该位点的基因型是TT,而突变体在该位点为tt, 杂合体为Tt。群体构建方案的理论基础就是遗传学三大定律, 首先是根据孟德尔的分离定律和自由组合定律。假设已知要