双向凝胶电泳的图像分析.pptVIP

第四章 双向凝胶电泳的图像分析 第一节 概述一、图像分析工具 1.硬件设备： 一定的电脑配置,Pentirm 166处理器，64M内存，3G硬盘，1024*768分辨率 ，256色，SCI接口，windows操作系统 2.软件技术： PDQuest双向凝胶图像分析软件，Bio-Rad Laboratory,Hercules,CA 二、图像分析流程 双向电泳图谱经扫描或摄影等转换为像素为基础、具有不同灰度强弱和一定边界方向的斑点的电脑信号。 典型流程： 凝胶图像的扫描： 图像加工： 斑点检测和定量： 凝胶配比： 数据分析： 数据呈递（report） 2-DE数据库的建立： 第二节 双向凝胶电泳图像采集 透射扫描——灵敏度高 根据吸收光度的大小获得蛋白质点的光密度信息——光密度值与蛋白点的表达丰度成正比 根据各个蛋白点的密度值进行蛋白质量的相对大小分析。 第三节 双向电泳凝胶图像分析原理 一、蛋白质斑点检测 包括：胶内点的定位、点的形状确定及点的体积（丰度）和面积的计算。 点的检测是各步分析的基础。为了缩短处理时间，检测前预先要用鼠标圈定要处理点所在的区域，处理区域越小，后续分析所耗费的时间就越短。 斑点检测产生x/y位置的n数组、形状参数和整合的斑点强度。 二、算法 是对凝胶中的蛋白质的斑点经扫描后获得的数据，进行检测、评判和定量分析的过程。 原理：是以每一个像素点为中心构建算子，然后比较算子中心与边缘的吸光度，如果中心与边缘的强度相比足够大，则此像素点被认为是某蛋白质点的一部分，如此重复对每一个像素点进行有哪些信誉好的足球投注网站，最终构建该凝胶的图谱。 高斯拟合和高斯拉普拉斯变换斑点检测法。 三、数字化图像加工 图像增强：平滑操作、增强对比度、边缘检测和背景消减是图像加工最熟悉的工具。 例如：在双向电泳凝胶的数字化图像上分析蛋白质斑点。平滑操作、增强对比度、边缘检测和背景消减是以一种精确的方式来决定蛋白质斑点的形状和大小。在某些领域，这些操作主要用于图像增强，以提高图像的光学质量，分析科学可依靠这些操作提供明确的数据。 第四节 蛋白质点的检测 一、检测方法 自动执行：软件将在设定的算子大小下根据凝胶背景等因素确定最佳灵敏度来识别凝胶中的蛋白质点。 手动执行：首先在整个分析范围内选定一个代表区域，进入一个有9个格子的小窗口，在每一个格子中都反映所选代表区域点检测的执行情况 二、点检测 假设斑点区域的灰度值显著高于背景的灰度值，并且它们与背景区域有一个界线，所要求的阈值可自动适应每一个新的图像。 应用这些标准后，仍存在一些区域，既不是斑点区域，也不是部分斑点区域。把一凝胶图像认为是一个表面时，斑点的形状是明显凸起的，部分斑点区域也是如此。第二代计算机衍生系列描述了分水岭拓扑地貌的曲率，斑点和部分斑点就可以用数学方法求解。斑点区域和部分斑点区域应该有相同的凸起曲率。 三、背景消减 点检测完成后，所得到的蛋白质点的体积是一个绝对值，由构成该蛋白质点的各个像素吸光强度的值累加得到，在凝胶背景较深时，这些背景值将会被叠加到点体积中去，因而使蛋白质点体积与实际值相比要略微偏高。 一些图像分析软件可在分析前对图像做平滑、对比度调节和背景消减等处理。 四、归一化处理 对点的体积进行归一化处理，以便于对不同胶上的同一蛋白质点进行准确客观的相对定量。 所有点的含量通过单个点的光密度值比上胶上所有点光密度值 归一化处理后的数据是否合理决定着图像分析数据统计学分析的可靠性。 第五节 凝胶配比分析 一、原因 通过多次凝胶电泳的结果提高实验的可靠性，就需要进行不同凝胶间斑点的配比分析。 包括：凝胶的匹配和斑点的比较 匹配的目的是为了对已经进行了点检测的凝胶之间找出代表同一蛋白质的点。匹配过程能把位于不同凝胶上的同一蛋白质点联系起来，比较则是在不同凝胶上对同一蛋白质点的蛋白质进行不同凝胶上的蛋白质表达情况的分析。 二、注册 注册是一种通过转化的方式使数据进行比较的步骤。 三、配比 （1）像素水平上：两种凝胶图像的像素绘成图形。 （2）斑点水平上：仅对两块或多块凝胶上的蛋白质斑点进行匹配，已达到整个凝胶的匹配。 四、比较 第六节 数据分析 涉及到质的准确性评估，量的确定，表达中的定量变化 第七节 数据呈递 每个蛋白质斑点应该有一个相对分子质量（Mr)和等电点（pI）。因此利用某些特征的蛋白质斑点（参考胶上的斑点），一种Mr /pI晶格形式就覆