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* * 荧光技术原理及应用 陶 亮 中山医学院药理学教研室 光的基本知识 一、光的本质：光是一种可见的电磁波，是能量的辐射形式 光的波长越长，光子的能量越小 光波 波长 γ射线 10-5～10-3nM X线 10-4～0.1nM 远紫外 10 ～20nM 紫外 200～400nM 可见光 400～760nM 红外 0.76～50μM 远红外 50～1000μM 微波 0.1～100cM 无线电波 1～100M 二. 光的性质： 粒子性 —— 光子（光量子） 波动性 —— 光沿直线传播，在与它前进方向垂直的平面内呈波形振动 波长 — 光的颜色 振幅 — 光的亮度 波长 振幅 波长长（频率低）— 光子能量小 波长短（频率高）— 光子能量大 三. 光的吸收 光进入某物质后，部分或全部的光能可被物质的分子或原子所吸收。 物质吸收能量后进入激发态，当物质从激发态回到基态时，以电磁辐射的形式（或热）放出所吸收的能量——发射光。 光的吸收具有选择性 — 一定能量的光量子辐射只能被一定结构的物质吸收 滤光片— 吸收一定波长范围的光，允许特定波长的光通过 （一）荧光 — 物质中的电子吸收光的能量由低能状态转变为 高能状态，再回到低能状态时释放出的光 荧光是冷光，颜色为蓝、绿、红和黄色 三.荧光的基本知识 2. 荧光产生的原理 无论那种荧光，其发光机理是相同的 由光激发的荧光 — 光致荧光 由化学反应引起的荧光 — 化学荧光 由X射线引起的荧光 — X射线荧光 由激光引起的荧光 — 激光荧光 化学荧光在有生命的生物体中产生 — 生物发光 3.荧光素(荧光物质，荧光染料，荧光探针) — 能够产生荧光的化合物 发射荧光的光量子数 荧光效率= —————————— 吸收光的光量子数 反应物质将吸收的光能转变成荧光的效率—越大越好 荧光素的荧光效率0.35 斯托克斯位移（Stokes shift） 物质在激发过程中吸收的能量，要高于荧光发射的能量。 荧光素的发射波长总是大于其激发波长。 两者的差值 — 斯托克斯位移（Stokes shift）； — 激发到发射过程中存在能量损失 hvEX— hvEM = 荧光效率 利用斯托克斯位移现象，分离激发光和发射光 4. 荧光素的性质 （1）激发光波长和发射光波长 荧光素 激发光波长——近紫外区域，可见光区域 发射光波长——可见光区域 发射光波长 激发光波长 根据荧光素的激发光波长和发射光波长选择光源和滤光片 （2）激发光谱和发射光谱 荧光素的激发光谱和发射光谱反映了该荧光素的光化学性质 激发光谱 — 荧光素的荧光发射强度随激发光波长变化的光谱 吸收光谱 发射光谱 — 荧光素的荧光发射强度随发射光波长变化的光谱 Wavelength Excitation Spectrum Emission Spectrum λEX λEM 激发光谱和发射光谱的用途 激发光谱—确定荧光素适宜的激发波长的依据 发射光谱—确定荧光素检测波长的依据 最大激发波长 λEX 最大发射波长λEM 激发光谱和发射光谱可用来鉴别荧光物质 — 每一种荧光物质都有其特定的激发光谱和发射光谱 （3）荧光强度 荧光强度 —— 荧光素发射荧光的光量子数 决定荧光素检测的灵敏度 荧光素的荧光效率决定其荧光强度 （4）荧光寿命 荧光寿命（激发态寿命）—电子在激发态的平均停留时间 荧光寿命长 — 检测特异性和灵敏度高 荧光物质受激发时，其发射荧光的能力逐渐下降并最终丧失 —— 漂白 （5）荧光漂白 （6）自发荧光 组织或细胞中的某些成份受激发时可发出荧光 — 自发荧光 荧光染料的发展简史 1838年 Brewster首次描述了荧光现象 1852年 Stokes发现并描述荧光物质（荧光染料） 1903年 Wood设计出可选择透过紫外光的滤光片 1911年 Reicherl发明荧光显微镜 1935年 Haitinger 将荧光物质用于固定的细胞和 组织，活细胞染色 新的荧光探针，新的检测技术不断出现 荧光技术已用于整体、器官、细胞、分子水平生命现象的研究 常用的荧光染料（探针） 一. 细胞器荧光探针 —— 能渗透到细胞内，选择性地与细胞器结合的