白细胞的检测方法.docVIP

第四章 白细胞检验的基本方法 第一节 白细胞功能的检验 一、墨汁吞噬试验 【目的】 掌握墨汁吞噬试验的原理、方法、注意事项和临床意义。 【实验原理】 墨汁吞噬试验（ink phagocytosis test）是依据血液中的中性粒细胞及单核细胞对细菌、异物等具有吞噬作用，在一定量的肝素抗凝血中，加入一定量的墨汁，经37℃温育4h，涂片染色后，在显微镜下观察吞噬细胞对墨汁的吞噬情况，并计算吞噬率及吞噬指数，从而协助急性白血病的诊断与鉴别。 【材料】 1．器材 试管、移液管、微量移液器、载玻片、37℃水浴箱、显微镜等。 2．试剂 （1）肝素：配成6U/ml水溶液。 （2）制备墨汁：于普通砚台上加生理盐水5ml，以优质中国块墨或印度墨，以100r/min研磨3min。所得墨汁经普通滤纸过滤3次备用。 （3）瑞氏染液等。 【方法步骤】 1．取小试管1支，加肝素20μl，加外周血100μl，混匀。 2．加入过滤墨汁10μl，混匀，加塞。 3．置37℃温育4h。 4．取温育后样本，推制成血涂片，干燥后，瑞氏染色。 5．油镜下观察计数幼稚细胞或中性成熟粒细胞100个；计数单核细胞20个。 6．判断结果 根据细胞吞噬墨粒多少及大小，可定为下列程度： 阴性：细胞内未见吞噬墨粒。 阳性：(+) 细胞内吞噬有小墨粒1～5个。 (++) 细胞内吞噬有大小不等墨粒10个左右。 (+++) 细胞内吞噬有大墨粒10个左右，小墨粒较多。 (++++) 细胞内吞噬有多数大颗墨粒，并有块状、球状，小墨粒很多，但细胞核清楚。 7．计算吞噬率及吞噬指数 吞噬率（%）= ×100% 吞噬指数= 【注意事项】 肝素剂量对白细胞的吞噬功能有影响，肝素用量过大，细胞形态异常，吞噬率和吞噬指数降低；肝素用量过小，影响抗凝。以每100μl血用0.3U肝素为最适宜。 【参考范围】 成熟中性粒细胞吞噬率59～89%，吞噬指数66～186； 成熟单核细胞吞噬率90～100%，吞噬指数227～399。 【临床意义】 临床上可利用该试验了解吞噬细胞的吞噬功能，对白血病的诊断和分型有一定参考价值。粒细胞仅成熟阶段才具有吞噬功能，单核细胞幼稚阶段和成熟阶段均具有吞噬能力。AML-M5a为弱阳性，M5b吞噬指数明显增高。AML-M2、ALL和AML-M3吞噬试验均为阴性，AML-M4呈阳性反应。CML的成熟粒细胞吞噬能力明显降低。 二、白细胞吞噬功能试验 【目的】 掌握白细胞吞噬功能试验的原理、方法、注意事项和临床意义。 【实验原理】 白细胞吞噬功能试验（leukophagocytic function test），是将待测的白细胞与葡萄球菌混合，37℃温育一定时间后，细菌可被中性粒细胞吞噬，涂片染色后，在显微镜下观察中性粒细胞吞噬细菌的情况，计数吞噬细菌的白细胞数以及被吞噬的细菌总数，计算吞噬率和吞噬指数，据此反映中性粒细胞的吞噬功能。 【材料】 1．器材 接种环、小试管、微量细胞培养板、水浴箱、载玻片、显微镜等。 2．试剂 （1）制备菌液：取在琼脂斜面上或平板上培养24h的白色葡萄球菌菌苔，用PBS（0.015mol/L pH6.4）洗2次，沸水浴15～20min灭菌。将灭活菌液混悬于20% FCS-RPMI1640培养液中，用比浊法调整细胞浓度至5×1010/L，置4℃备用。 （2）100U/ml肝素、甲醇、吉姆萨染液等。 【方法步骤】 1．于微量细胞培养板孔内（或小试管内）加100U/ml肝素1滴，无菌采集末梢血3滴，与孔内抗凝剂立即混匀。 2．向孔内（或小试管内）加白色葡萄球菌悬液3滴，混匀。 3．置有盖湿盒内，37℃温育30min，每10min轻摇一次。 4．用滴管取1滴培养液，推成薄片，甲醇固定，吉姆萨染色、干燥。 5．镜检计数 油镜下观察计数200个中性粒细胞，记录吞噬细菌的细胞数，以及各个细胞吞噬的细菌总数，按下式计算吞噬率和吞噬指数。 吞噬率（%）= ×100% 吞噬指数= 【注意事项】 1． 所用器材要清洁。 2． 抗凝剂用量应适当，过高会抑制吞噬功能，过低则易出现血液凝固。 3． 要严格掌握吞噬的时间和条件。细菌与细胞比例以1∶1～10为宜。 4． 涂片要薄，以便尽量减少因细菌重叠在细胞上而误以为吞噬的错误。 5．计数时应取载玻片前、中、后三段计数，以提高准确性。 6．本试验采用光学显微镜检查，分辨率不够高，有时难以准确计数吞入的细菌颗粒，应认真识别。 7．应根据各室的具体方法建立本室