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G-50的洗涤与保存 葡聚糖凝胶的简介 葡聚糖凝胶（Sephadex）是一种由一定平均分子量的葡聚糖和交联剂1-氯-2,3-环氧丙烷交联而成的具有三维结构不溶于水的高分子化合物。调节交联剂的配比，可以获得网眼大小不同，型号各异的凝胶。当葡糖糖分子量越小，交联剂用量越大，则交联度越大，凝胶网眼越小，吸水量越少，G值也越少。 G后面的阿拉伯数为凝胶得水值的10倍。 常用的葡聚糖凝胶有多种规格，如G-10、G-15、G-25、G-50、G-70、G-100。实验中选择何种型号应根据待分离混合物分子的大小和实验目的来确定。如：G-50表示每克凝胶膨胀时吸水5克， G-50的作用原理—分子筛效应 分子筛效应 分子筛是一些多孔的介质，当含有不同大小的分子的混合物流经这一介质时，小分子物质都能进入介质内部空隙，而大分子物质被排阻在介质外，从而达到分离的目的。 当混合样液加入到凝胶柱上，随着洗脱剂而通过凝胶柱时，分子大小不同的物质受到不同的阻滞作用。颗粒接近或大于网眼的分子，不能进入凝胶的网眼中，在重力的作用下他们随着溶剂在凝胶颗粒之间沿较短流程向下流动，受到的阻滞作用小，移动速度快，先出层析柱：而颗粒小于网眼的分子可渗入凝胶网眼中，他们被洗脱时从一个网眼流到另一个网眼，受到的阻滞作用大，流程长，后出层析柱。在层析柱出口用不同试管收集洗脱液，便可把混合液中各组分彼此分离。 实验用仪器及材料 实验仪器及设备 层析柱、滴定台架、螺丝夹、移液管、烧杯、洗耳球、滴管、洗瓶、试管架、移液管架、玻璃棒。 实验对象及材料 1.葡聚糖凝胶G-50 溶胀凝胶方法：取4g葡聚糖凝胶G-50于烧杯，加过量蒸馏水于沸水浴中溶胀2小时或室温下溶胀6小时以上。用倾斜法除去上层漂浮的细碎凝胶，重复3~4次。操作中避免剧烈搅拌，防止破坏交联结构。 实验用仪器及材料 2.洗脱剂 PBS 实验步骤 1.层析柱的准备 （1）清洗:取一只层析柱，用清水清洗干净。（若层析柱较脏，卸去塑料装置，用洗液浸泡两小时） （2）安装与检查：检查出口装置中尼龙绸或烧结滤板是否干净。安装层析柱，让其垂直固定于滴定台架上。对准出口处，放一只250ml的烧杯。向层析柱灌洗脱剂，打开出口螺旋夹，检查是否渗漏、出口乳胶管是否畅通等。 实验步骤 （3）排气泡：保持柱内一定的水位，用手指弹击柱壁，气泡从溶液中上浮排除。（若出口处的气泡停留在螺旋夹附近的凝胶管内，应想办法排尽，否则影响分离结果。）排气完毕，保留柱内1~2cm高水位，关紧螺旋夹。 （4）标记高度：在据顶端8~10cm处做一标记，为衡量灌床高度（15~17cm）的依据。 实验步骤 2.装柱 用50ml烧杯取溶胀的凝胶悬浆25~30ml，静置片刻，观察凝胶沉淀与水的体积比，约1:1即可，否则调整。 轻轻搅匀杯中凝胶，用玻璃棒引流入住，并不断向柱内补充凝胶，直到凝胶沉淀位于标记上方约2cm为止。（凝胶柱若有气泡和断层或柱床表面倾斜，都将影响分离结果，必要时倒出重装。） 3.平衡 取15ml洗脱剂，用滴管沿柱内壁旋转着缓缓流下，不要冲动胶平面，打开出水口，经洗脱剂的流动，一方面清洗内壁，另一方面使胶床收紧。洗脱平衡完毕，胶床上方保留4cm高水位，关闭出水口。此时，胶床高度≥15cm为宜。 实验步骤 4.上样与收集 取若干只干净试管，并做标记，以备收集洗脱样品 打开出口排水，当胶床与上方水层弯月面相切时，关闭出口。用滴管将0.2ml混合样液沿柱壁缓缓加入，勿冲动胶面。上样完毕，打开出水口，开始收集1号管。 实验步骤 当样液进入胶床，暂停排液，用滴管将洗脱剂沿柱内壁旋转着加入1cm高水位，然后排液，至其弯月面与胶平面相切，再缓缓注入3~5ml高的洗脱液。 实验步骤 G-50的洗涤与保存 7.G-50洗涤保存的目的 交联葡聚糖是多糖类物质 , 适宜微生物生长。微生物分解的酶能水解多糖的糖苷键 , 或因流洗液、保存液不纯 , 混杂氧化剂或细菌 , 导致多糖羟基氧化 , 或糖苷键水解、断裂 , 从而改变凝胶的层析特性 , 影响层析分离效果。因此 , 我们的洗脱过程尽量使用超纯水 , 以避免细菌或氧化剂污染。对使用过的凝胶若较长时间不用 , 必须加入防腐剂 ,并置于 4℃ 冷藏箱内保存; 或脱水处理使其恢复干粉状保存备用。 5.洗脱收集 不断向柱内加剂，保持胶床上水位3~5cm，出口流速控制在6秒1滴，直至所有试管收集完毕，关闭出口。 6.再生 收集完毕后，继续用2~3倍的洗脱液洗脱，洗脱后关闭出口，以备下次使用。