生物技术制药-第二章-基因工程制药201309-201401-22.pptVIP

第一节 概 述 利用基因工程技术生产药品的优点： （1）可以大量生产过去难以获得的生理活性蛋白和多肽； （2）可以提供足够数量的生理活性物质； （3）利用基因工程技术可以发现、挖掘更多的内源性生理活性物质； （4）基因工程和蛋白质工程进行改造和去除内源性生理活性物质的不足之处。 （5）利用基因工程技术可获得新型化合物，扩大药物筛选来源。 第二节 基因工程药物生产的过程 基因工程技术是将所要重组对象的目的基因插入载体、拼接，转入新的宿主细胞，构建成工程菌(或细胞），实现遗传物质的重新组合，并使目的基因在工程菌(或细胞）内进行复制和表达的技术。 基因工程药物生产的上游和下游 上游阶段：目的基因分离、工程菌（或细胞）构建。上游阶段的工作主要在实验室内完成； 下游阶段：主要指的是从工程菌（或细胞）的大规模培养一直到产品的分离纯化、质量控制 基因工程药物制备的一般过程 基因工程基本过程 工程菌（或细胞）构建中重要的工具 工具：酶 限制性内切酶 连接酶 逆转录酶 Klenow 酶大片段（DNA聚合酶 I） 核酸酶S1 第三节 目的基因的获得 克隆真核基因常用方法：逆转录法和化学合成法。（不能直接分离？） 一、逆转录法 逆转录法就是先分离纯化目的基因的mRNA，再反转录成 cDNA，然后进行 cDNA 的克隆表达。 cDNA与模板mRNA序列严格互补，而不含内含子。 逆转录法的步骤 1、mRNA的纯化 2、cDNA第一链的合成 3、cDNA第二链的合成 4、cDNA克隆 5、将重组体导入宿主细胞 6、cDNA文库的鉴定 7、目的cDNA克隆的分离和鉴定 cDNA克隆示意图 三、化学合成法 较小的蛋白质或多肽的编码基因可以用化学合成法合成。 必须知道目的基因的核苷酸顺序或目的蛋白质的氨基酸顺序。 人工化学合成的限制：一不能合成太长的基因，50～60bp；二是人工合成时，遗传密码的简并性可导致中性突变；三是费用较高。 四、筛选基因的新方法 五、对已发现基因进行改造 第四节 基因表达 基因表达：是指结构基因在生物体中的转录、翻译以及所有加工过程。 基因高效表达：将外源基因片段拼接到另一个基因表达体系中，使既获得原生物活性又可高产的表达产物。 最佳的基因表达体系：生物活性高、表达产量高、表达产物稳定、表达产物容易分离纯化。 一、宿主细胞的选择 好培养， 快速长， 少危害， 易重组， 高量率， 简提纯。 宿主细胞常用两大类： 原核细胞：常用有大肠杆菌、枯草芽胞杆菌、链霉菌等； 真核细胞：常用有酵母、丝状真菌、哺乳动物细胞等。 原核细胞 ⑴大肠杆菌：基因工程研究中采用最多的原核表达体系。 优点：生长快速、代谢简单、遗传体系清楚、容易操作、细胞破碎容易。 缺点： ① 不存在导向内质网的信号序列，分泌能力不足，产品多为胞内产物，提取困难； ②蛋白表达后不能修饰加工（糖基化等）； ③产物蛋白质N端多余一个蛋氨酸残基，能引起免疫反应； ④内毒素存留。 ⑵枯草芽胞杆菌： 分泌能力强，蛋白质不形成包含体。产物蛋白质不能糖基化。有很强的胞外蛋白酶对产物降解。 ⑶链霉菌： 作为外源性基因表达受到重视。不致病、使用安全、分泌能力强、表达产物可糖基化。 真核细胞 ⑴ 酵母 是研究基因表达最有效的单细胞真核微生物。其基因组小，世代时间短，有单倍体双倍体两种形式，繁殖迅速，无毒性。能外分泌，产物可糖基化。已有不少真核基因成功表达。 ⑵丝状真菌 优点：分泌能力强，能正确进行翻译后加工（肽剪切、糖基化）有成熟的发酵和后处理工艺。 ⑶哺乳动物细胞 优点：表达产物可由重组转化细胞分泌到培养液中，纯化容易。产物是糖基化的接近天然物。 缺点：生长慢，生产率低，培养条件苛刻，费用高，培养液浓度稀。 二、大肠杆菌体系中的基因表达 常用表达载体 pBV220系统 pBG-2是由pBV220系统衍生的便于产物纯化的融合表达载体。 该质粒在PRPL启动子下游插入G蛋白中与IgG Fc段结合的结构域基因片段180个核苷酸，下游是多克隆位点，引入了剪切融合蛋白的切点，具有与IgG结合的活性，可用亲和层析。简化下游工艺。 （二）影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素 ⑴外源基因的剂量 外源基因拷贝到高拷贝数的表达质粒上，总体表达水平提高 ⑵ 外源基因的表达效率 与启动子强弱，核糖体结合位点的有效性，SD序列与起始密码的间距，密码子的组成等都影响其表达效率 （三）真核基因在大肠杆菌中的表达形式 ⑴以融合蛋白的形式表达药物基因 以原核多肽和真核蛋白结合在一起称融合蛋白。 优点：操作简便，表达蛋白在菌体内稳定，易实现高效表达