河北医科大学荧光定量pcr的原理与应用.pptVIP

荧光定量PCR原理及其应用 免疫教研室 杨建岭 第一代常规双链DNA内掺式染料： 溴化乙锭 (EB) 首个应用于均一实时检测的方法 Russell Higuchi et al. 1992Simultaneous amplification and detection of specificDNA sequences. BioTechnology 10:413–417 荧光信号随双链DNA的出现而增强 信号弱，并且EB对PCR扩增有毒性(抑制作用) 已不再使用 第二代常规双链DNA内掺式染料：  SYBR? Green I 定量分析——相对定量 使用??Ct法所要满足的条件： 定量分析——相对定量 待测组目的基因平均Ct值 待测组看家基因平均Ct值 对照组目的基因平均Ct值 对照组看家基因平均Ct值 F= 2 - 相对定量——??Ct法： 公式： — — — 应用：基因表达调控研究中最常用与公认的两种相对定量方法之一 ??Ct ?Ct待测 ?Ct对照 F=2 -??Ct 条件： 1.假定目的基因与看家基因的扩增效率一致 2.假定扩增效率为 100 % 缺点： 实验条件优化（使目的基因和看家基因扩增效率相同）较为复杂 优点： 优化的体系建立后，每次实验中无需再对看家基因和目的基因做标准曲线，而只需对待测样品分别进行PCR扩增即可 某科研用户使用Rotor-Gene 3000进行基因表达相对定量分析，下图为用??Ct法得出的分析结果 。（自备标准品，检测样品做3次重复复管） HouseKeeper Gene Gene of Interest 定量分析——相对定量 ??Ct 双标准曲线法 相对定量方法二——双标准曲线法 应用：基因表达调控研究中最常用与公认的两种相对定量方法之一 公式： 待测样品目的基因浓度 待测样品看家基因浓度 对照样品目的基因浓度 对照样品看家基因浓度 F= 优点：消除了由Ev差别而造成的误差，结果更为准确，分析简单， 实验优化简单 缺点：对每一个基因，每一轮实验都必需做标准曲线 相对定量——双标准曲线法 某科研用户使用Rotor-Gene 3000进行基因表达相对定量分析，下图为用双标准曲线法得出的分析结果 Comparative Delta-delta Ct法定量 先进行预实验，验证目的基因与看家基因的扩增效率是否一致，具体操作如下： 先将标准品进行系列稀释作为模板，分别扩增看家基因和目的基因，分别做看家基因和目的基因的标准曲线，比较两个标准曲线的斜率。如果斜率之差小于0.1，说明两者扩增效率相同，可以用比较CT值法进行相对定量 完成了上述预试验后，接下来对待测样品和对照样品进行相对定量分析 首先分别对待测样品和对照样品的目的基因和看家基因进行扩增，然后将扩增的样品页面进行编辑，将目的基因和看家基因通过“yes”“no”的设定，分别列在两页中，相同的样品命名相同的名称，然后分别分析两页。分析完两页后进入Delta Delta CT 分析界面，进行分析 Comparative Delta-delta Ct法定量 P1 相同的样品在两页里命名成相同的名称，并定义为unknown 分别分析P1和P2页 选delta-delta Ct选项 依次填入，并定义对照样品 完成分析 P2 公式 特点及注意事项 优点：当优化的体系已经建立后，在每次实验中无需再对看家基因和目的基因做标准曲线，而只需对待测样品分别进行PCR扩增即可。 缺点：每次实验都默认目的基因和看家基因的扩增效率一致，而并非真实扩增情况的反映，这里势必存在一定的误差。 注意事项：在预实验中，必需对目的基因和看家基因做两组标准曲线。Rotor-Gene 的软件会自动给出两组标准曲线的R值、扩增效率等信息，如果两组标准曲线的斜率，即M值的差小于0.1，那么后续实验中就可以用Comparative Delta-delta Ct法进行相对定量分析。反之，如果M差值大于0.1，就无法用该方法进行相对定量分析。此时的解决方法有两种，一是优化实验，使两组标准曲线的斜率差值小于0.1，二是换用其它的相对定量方法。 将标准品进行梯度稀释后，分别对目的基因（Gene of Interest）和看家基因（Housekeeper Gene）做标准曲线。 预试验