重庆医科大学细胞生物学---第十一章-细胞工程.pptVIP

一、基因转染原理 将目的基因导入靶细胞, 使之表达 涉及到基因，基因表达元件， 导入方法， 导入细胞，表达检测 导入方法很多，大致可分为：物理法、化学法和生物学方法 二、基因转染载体 病毒载体 逆转录病毒载体 腺病毒载体 腺相关病毒载体 单纯疱疹病毒载体 EB病毒载体 杆状病毒 慢病毒 嵌合 (杂合 )病毒载体 细菌载体 噬菌体载体 三、基因转染方法和原理 包装细胞(packaging cell) 4. 逆转录病毒载体的特点 假病毒颗粒RNA不含逆转录病毒结构基因，被目的基因和标记基因取代 具有感染靶细胞的能力，只能感染处于增殖期的细胞 能通过逆转录过程转变成前病毒，并整合于宿主细胞的染色体上 转化宿主细胞，并稳定表达导入基因 靶细胞不含病毒的包装序列，因而不会产生新的完整病毒颗粒 非病毒载体 磷酸钙转染法 DEAE-葡聚糖转染法 脂质体介导 多聚阳离子聚合物 电击法 显微注射法 基因枪 超声波辅助转染 （一）化学法介导的基因转染 1.脂质体介导的转染 DNA通过脂类包被而被转染，这些脂类或者直接与细胞膜相互作用——膜融合；或者通过非受体介导的内吞作用进入细胞，推测这可能是在内吞小体内进行膜融合。 转染复合物形成过程示意图 脂质体 膜融合 脂质体转染流程图 2.磷酸钙转染法 基本原理：HEPES/BES缓冲盐水与含有CaCl2及DNA的溶液缓慢混合可形成含磷酸钙和DNA的沉淀。细胞经内吞作用将磷酸钙/DNA沉淀吸收。 提高磷酸钙转染效率方法 氯喹处理细胞：氯喹为弱碱性，抑制细胞内溶酶体对DNA的降解作用。1:1000加入100 mmol/L的氯喹加入到培养基中 丁酸钠处理细胞：机制不明,但它是组蛋白脱乙酰基抑制剂,推测丁酸钠会导致组蛋白过乙酰化形成是外来质粒DNA趋于转录的染色质结构。将500mM丁酸钠直接加入转染后的细胞培养基中 甘油处理细胞 3. DEAE-葡聚糖转染法 基本原理： DEAE-葡聚糖是一种高分子量的正电荷多聚体， DEAE-葡聚糖的作用机制并不甚明了，推测由于高分子量正电荷多聚体可以作为桥梁连接带负电荷的核酸与带负电荷的细胞外膜。 DEAE-葡聚糖/DNA复合体通过内吞作用进入细胞后，DNA通过某种未知机制脱离酸度越来越大的内吞小体，穿过核膜进入核内。 400 80 160 240 200 40 80 120 100 20 40 60 50 10 20 30 DEAE-葡聚糖在培养液 DNA/TBS 10mg/ml DEAE-葡聚糖 总体积 中的终浓度(ug/ml) (ul) (ul) (ul) DEAE-葡聚糖最适浓度测定 1.电穿孔转染法 电穿孔的攻击引起膜凹陷然后瞬时形成直径波动在2nm至数纳米之间的疏水小孔。 某些较大的疏水孔转变成亲水性的小孔。分子穿过亲水性小孔的详细机制未知，可能包括电泳、电内渗透、扩散与内吞作用。当小孔开放时，最多可有0.5pg的DNA进入细胞。150kb的DNA可轻易通过小孔，可见DNA分子的大小并不妨碍其进入细胞，DNA不接触内吞小体与溶酶体的酸性环境而直接进入胞质。 （二）物理法介导的基因转染 2.显微注射法 受精卵显微注射技术是制备转基因动物最常用的方法，其基本操作程序是：将目的基因经过适当的限制性内切酶酶切、纯化并溶解在注射缓冲液中备用。显微注射时先从供体动物的输卵管内取出受精卵，利用倒置显微镜和显微操作系统将所要研究的基因注射入受精卵的雄原核，再将此受精卵植入受体动物的输卵管中，使其发育成携带有外源基因的转基因动物。 显微操作系统 显微注射 3. DNA直接注射法 DNA直接注射法主要用于开发核酸疫苗和基因治疗。核酸疫苗也叫基因疫苗（