NKAIN2真核表达载体的构建与表达鉴定.PDFVIP

论　 　 著 （基础研究） ＮＫＡＩＮ２真核表达载体的构建与表达鉴定 罗　 飞，周柏伟，黄梦怡，吕永杰，赵善超 　 　 ［摘要］　 目的　 ＮＫＡＩＮ２基因位于６号染色体长臂，６号染色体长臂的缺失现象经常发生于各种肿瘤。 现构建候选抑癌 基因ＮＫＡＩＮ２真核表达载体，使其在前列腺癌细胞２２ＲＶ１中过表达并观察其细胞定位，为进一步功能研究奠定实验基础。 　 方法　 采用ＰＣＲ方法扩增ＮＫＡＩＮ２基因序列，将其重组于ｐｃＤＮＡ４载体中，利用ＰＣＲ和ＤＮＡ测序鉴定克隆正确性；并转染到 ２２ＲＶ１细胞，Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ检测其蛋白表达，免疫荧光检测其在细胞中的定位。 　 结果　 重组质粒中插入正确目的片段，片段 大小为６２７ｂｐ，与预计位置相符。 Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ 检测表明，在２５０００处检测到目的蛋白条带，与预计大小相符，而阴性对照未检 测到相应条带，说明真核表达载体成功转染细胞，并且能够瞬时表达。 转染了ｐｃＤＮＡ４⁃ＦＬＡＧ⁃ＮＫＡＩＮ２质粒的２２ＲＶ１细胞在 Ｐｅｔｒｉ皿培养２４ｈ后可测到转染的带ＦＬＡＧ⁃ＮＫＡＩＮ２片段的蛋白表达，且过表达的蛋白主要定位于细胞膜和细胞质中。 转染未 带ＦＬＡＧ标签的ｐｃＤＮＡ４ 质粒未检测到蛋白荧光信号。 　 结论　 成功构建了ｐｃＤＮＡ４⁃ＦＬＡＧ⁃ＮＫＡＩＮ２ 真核表达载体，转染 ２２ＲＶ１细胞后高表达，为进一步研究ＮＫＡＩＮ２在前列腺癌中的生物行为和其发生发展的相互作用机制提供基础。 　 　 ［关键词］　 ＮＫＡＩＮ２；抑癌基因；真核细胞；载体构建 　 　 ［中图分类号］　 Ｒ７３７．２５　 　 　 ［文献标志码］　 Ａ　 　 　 ［文章编号］　 １００８⁃８１９９（２０１６）１１⁃１１６３⁃０４ 　 　 ［ＤＯＩ］　 １０．１６５７１／ ｊ．ｃｎｋｉ．１００８⁃８１９９．２０１６．１１．０１０ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｏｆ ＮＫＡＩＮ２ １ １ ２ ３ １ ＬＵＯ Ｆｅｉ ，ＺＨＯＵ Ｂｏ⁃ｗｅｉ ，ＨＵＡＮＧ Ｍｅｎｇ⁃ｙｉ ，Ｌｕ Ｙｏｎｇ⁃ｊｉｅ ，ＺＨＡＯ Ｓｈａｎ⁃ｃｈａｏ （１．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｕｒｏｌｏｇｙ，Ｎａｎｆａｎｇ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，ＳｏｕｔｈｅｒｎＭｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ５１０５１５，Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ，Ｃｈｉｎａ； ２．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆ Ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，ＳｏｕｔｈｅｒｎＭｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ５１０５１５，Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ，Ｃｈｉｎａ；３．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｂａｒｔｓ ＣａｎｃｅｒＩｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｂａｒｔｓ ａｎｄ ＴｈｅＬｏｎｄｏｎＳｃｈｏｏｌｏｆ ＭｅｄｉｃｉｎｅａｎｄＤｅｎｔｉｓｔｒｙ，ＱｕｅｅｎＭａｒｙ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｌｏｎｄｏｎ，Ｌｏｎｄｏｎ ＥＣ１Ｍ６ＢＱ，ＵＫ） 　 　 ［Ａｂｓｔｒａｃｔ ］　 Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　 ＮＫＡＩＮ２ ｇｅｎｅ ｉｓ ｌｏｃａｔｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｌｏｎｇ ａｒｍ ｏｆ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ６，ａｎｄ ｔｈｅ ｌａｃｋ ｏｆ ｔｈｅ ｌｏｎｇ ａｒｍ ｏｆ ｃｈｒｏｍｏ⁃ ｓｏｍｅ６ ｏｃｃｕｒｓｆｒｅｑｕｅｎｔｌｙ ｉｎ ｖａｒｉｏｕｓ ｔｕｍｏｒ． Ｗｅ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｔｈｅ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｏｆ ＮＫＡＩＮ２ ｇｅｎｅ，ａ ｃａｎｄｉｄａｔｅ ｔｕｍｏｒ ｓｕｐ⁃ ｐｒｅｓｓｏｒ ｇｅｎｅ，ｗｈｉｃｈｗａｓｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎｐｒｏｓｔａｔｅｃａｎｃｅｒｃｅｌｌ２２ＲＶ１ａｎｄｃｅｌｌｌｏｃａｔｉｏｎｗａｓｏｂｓｅｒｖｅｄ，ｂｕｉｌｄｉｎｇｔｈｅｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｆｏｒｆｕｒｔｈｅｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｓｔｕｄｙ．　 Ｍｅｔｈｏｄｓ　 Ｔｈｅ ｃｏｄｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ