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琼脂糖电泳步骤之超级基础篇
琼脂糖电泳步骤之超级基础篇
一、电泳前准备
准备内容 作用 1.刷干净电泳制胶的梳子,板子,槽子,蒸馏水洗净晾干 防止不必要的重复污染,减少外来的污染。梳子干净有利于梳孔的形成。 2.检查电泳槽,根据情况更换buffer 排除电泳槽的电极接触不良,确保buffer的缓冲能力,减少污染。 3.根据DNA的分离范围选择合适的胶浓度并记录 达到较好的分离效果,防止样过快跑出胶或者是过慢浪费时间。 4.计算agarose的用量和制胶 buffer的用量记录,胶最终越薄越好。 实验记录备查 二、制胶步骤 注意事项 1.称量agarose和buffer Buffer不要用成H2O,称量相对准确 2.融胶,加热到胶产生大量的气泡时,拿出摇匀,继续加热到完全溶解,拿出摇匀,再加热到沸腾。 非常热,小心烫手,另外注意不要加热过度使胶冲出瓶子。因此注意选择起码为胶体积2倍以上的瓶子。保证胶混匀和完全溶解,减少可能因此引起的胶中孔径不均匀影响分离效果。 3.倒胶,可用水浴的办法使胶冷却到60度左右,即手可以握住瓶子的温度,沿着制胶板的一侧,缓缓地一次性倒入。梳子最好是预先放好并固定的,注意梳孔的体积能点的下所有的样。用枪头赶掉气泡。 制胶的桌面相对水平。倒胶时尽量减少气泡的产生。EB如果在制胶时加入,在60度左右时加入,使终浓度为0.5ug/ml。不宜过低,染色成像不明显;不宜过高,导致背景太深。摇匀要沿着瓶壁摇动,尽量减少气泡产生的可能性。高浓度胶例如2%以上的EB很难摇匀,而且凝的速度也相对快,强烈建议跑完胶之后再用EB染色。 4.室温凝胶30分钟 过程中不要碰到梳子,尽量保持胶的位置不移动。时间不宜过久,导致胶干燥变形;不宜过短,影响胶内部孔径形成。 5.拔梳子,放入电泳槽。 缓缓地将梳子垂直从梳孔拔出,尽可能使梳子是同时从各个胶孔拔出的。暂时不用的胶最好放入电泳槽电泳液中浸泡。电泳液要浸没胶1mm。 三、上样电泳步骤 注意事项 1.样品中加入loading buffer使其终浓度为1 X,混匀 Loading buffer浓度不宜过低,点样时样品不能很好的沉在胶孔里;不宜过高,电泳时容易形成带形的变形。注意混匀。 2.点样 沿着胶孔的边缘匀速加入。尽量避免碰坏胶孔。枪头不要吸过多的气泡,拔起时不要过猛带出样品。每点一个样完,吸取buffer洗枪头,避免样品混杂。如果是有特殊要求,例如回收,强烈建议每点一个样换一次枪头。加样的速度当然是越快越好,注意保证质量。点样的量不要太大,一方面是体积不要太大,溢出污染邻位样品;一方面两不要太大,容易导致脱尾和模糊不清。 3.接通电源,选择合适的电压和时间电泳。 胶孔与电极成水平状态,防止样品跑歪。跑胶期间不时回来看看,防止样品跑出胶等意外发生。 四、染色成像步骤 注意事项 1.染色 如果胶中没有加入EB,用0.5ug/ml的EB溶液浸染30分钟。 2.调整镜头的拍摄范围和焦距,成像 3.打印照片做分析记录
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