免疫功能分析-培训课件.pptVIP

不同蛋白转运抑制剂对细胞因子产生细胞检测的影响 应用PMA和Ionomycin刺激； GolgiPlug或GolgiStop阻断蛋白转运； TNF、IL-4抗体标记细胞内因子； GolgiPlug能够增强TNF的检测； GolgiStop增加IL-4的检测信号； 两者均不增加自发荧光信号； 蛋白转运抑制剂的作用机制 GolgiPlug，monensin为一种离子载体，阻断离子跨膜梯度转移； Brefedlin A，是真菌代谢产物干扰从粗面内质网到Golgi复合物的管道转运 A GolgiPlug、B GolgiStopC 无蛋白转运阻止剂 FcR阻断 对于小鼠细胞需要用于FcR阻断剂(纯化的抗Fc?II/III受体抗体)减少非特异性荧光染色； 对于人和兔细胞可以应用纯化同种的Ig或血清预先阻断Fc受体 细胞膜抗原标记： 细胞固定和膜通透 检测细胞内的细胞因子表达，细胞必须在穿透细胞膜前被固定，以维持细胞的结构完整性； 细胞固定选用paraformaldehyde:含4%(w/v)paraformaldehyde的中性pH缓冲液(Dulbeccos’ PBS) 细胞穿透选用去污剂saponin 应用抗体标记的缓冲液含代谢抑制剂叠氮钠(0.09%w/v)，抑制抗体结合引起的细胞膜蛋白的再分布 细胞经过固定和膜通透后，荧光标记的进入细胞内，到达Golgi与细胞因子结合； 目前已有多种形式的荧光标记的细胞因子抗体，包括FITC、PE、PerCP、APC等用于流式细胞术多参数分析 荧光素和抗体滴度 荧光素的选择：荧光强度FITCPEAPC依次增加；弱信号采用PE或APC，强信号采用FITC； 由于荧光素结合抗体容易产生高水平的非特异背景信号，最好预先测定最佳抗体浓度，否则存在假阳性 对照的设置 细胞固定和膜穿透后，应用同一克隆的无荧光素结合抗体处理，能够区分细胞因子特异和非特异染色 应用重组细胞因子蛋白预处理阻断荧光标记抗体结合，区分特异荧光和非特异荧光标记； 某些重组细胞因子反而增加非特异背景信号； 阴性对照和阳性细胞对照 荧光素结合的Isotype Ig作为阴性对照，阴性对照的抗体浓度应该与抗细胞因子抗体的浓度相同； 细胞内细胞因子阳性对照细胞：检测操作过程和抗体的特异性；抗体浓度的确定 单核细胞细胞内细胞因子分析 LPS是单核细胞的特异刺激剂 LPS刺激4小时全血 选定CD14-的淋巴细胞群和CD14+的单核细胞群 只有CD14+单核细胞群表达细胞因子TNF-? 完整细胞和膜通透细胞对细胞膜抗体标记的影响 全血和外周血单个核细胞比较 单核细胞产生细胞因子图谱 上图：IL-1? FITC/IL-1?a PE/CD14 PerCP/ TNF? APC； 中图： IL-1? FITC/ IL-1? PE/CD14 PerCP /TNF? APC； 下图： IL-8 FITC /IL-6 PE/CD14 PerCP /TNF? APC； 外周血树突状细胞 树突状细胞(dendritic cell, DC)是抗原摄取、处理和递呈给T淋巴细胞的专职抗原递呈细胞。 缺乏淋巴细胞、单核细胞、粒细胞的系特异性标记(Lin-)； 表达CD83和CMRF-44细胞膜标志； CD123、CD11c或HLA-DR DC定义为R3区、R4区及R5区 外周血DC局限于R7=R1 and R2 (R3 or R4 or R5)；红色为CD123+DC、绿色为CD11c+DC、蓝色为嗜碱细胞 注意事项： 细胞的穿透：未使用含穿透剂的溶液稀释抗体，降低细胞膜通透性结合抗体减少； 蛋白分泌的抑制：细胞激活过程未用蛋白转移抑制剂，细胞因子不能在细胞内蓄积； 细胞内标记前细胞的固定：细胞内标记前没有固定，含有Saponin的缓冲液导致细胞裂解和死亡； 适当的细胞活化体系： 非特异染色：FcR结合；抗体浓度过高。 免疫功能分析 淋巴细胞成分及功能 T细胞活化动力学 流式细胞术多参数分析 多参数分析的最大的优势是能够在混合细胞群中对特定细胞亚群进行分析； 如全血细胞的三色分析，CD3-PerCP选定CD3+细胞群，分析CD4+细胞CD69活化可以的表达； 淋巴细胞群的确定 淋巴细胞亚群的分布 T淋巴细胞的Th和Ts细胞亚群 NK细胞和B淋巴细胞亚群 Th和Ts细胞亚群早期活化细胞 Th和Ts细胞亚群中期活化细胞 Th和Ts细胞亚群辅助因子表达 CD28信号： 仅仅TCR复合物与MHC复合物相互作用不能诱导T细胞活化，导致细胞长期低反应性、无能或细胞死亡； 共刺激分子如CD28通过与APC细胞上的CD80/B7.1和CD86/B7.2相互作用，与TCR复合物共同诱导T细胞增殖、上调细胞因子及细胞因子受体的表达、上调涉及T细胞生存因子如Bcl-xL。 CD45R