流式细胞仪技术-培训课件.pptVIP

流式细胞仪技术在医学与生物学中的应用 流式细胞术( Flow Cytometry, FCM) 是一种对细胞或亚细胞结构进行快速测量及分选的技术。它利用高能量的激光照射高速流动的被荧光色素染色的单细胞（或微粒）,测量其产生的散射光和发射荧光的强度，对细胞(或微粒) 的物理性状、细胞的生理和生化反应、细胞免疫、血液病的诊断及治疗、移植医学、肿瘤细胞的增殖及凋亡、临床病菌的检验等进行定性或定量检测。在生物学、基础医学和临床诊断及治疗等领域得到广泛的应用。 光学系统 FCM的光学系统是由若干组透镜、滤光片、小孔组成，它们分别将不同波长的荧光信号送入到不同的电子探测器。 2. 液流系统 提 要 流式细胞仪使用的基本知识 流式细胞仪检测的生物学意义 流式细胞仪检测在临床诊断的应用 1 流式细胞仪使用的基本知识 前向散射光(FSC)与侧向散射光(SSC)的含义 荧光素的选择 检测通道的确定 自发荧光的产生 消除非特异性结合-FcR阻断 对照的设置 多色荧光补偿的调节 设门的意义 样品处理的要求 常用荧光染料的特性 检测通道的确定 通道 发射波长 荧光颜色 FL1 530/30 绿色 FL2 585/42 橙色 FL3 650 橙红 FL4 661/16 红色 FL2 - Area FL2 - Width 自发荧光的产生 末染色的细胞受到光照射后所发出的荧光称自发荧光。用流式细胞计测定细胞的特异性荧光染料的荧光时，这种自发荧光对所欲测定的特异性荧光是一种本底信号，自发荧光在多种情况下都会干扰特异性荧光信号，尤其是对低水平结合的荧光抗体它能减低染色的和未染色的细胞间的区别，使我们难以确定细胞中荧光信号的水平。自发荧光的强弱与细胞的大小、细胞的类型、激发光的波长、发射光的检测范围等都有关系。产生自发荧光的分子可能是正常细胞的组成成分如核黄素、细胞色素等。 消除非特异性结合-FcR阻断 对于小鼠细胞需要用于FcR阻断剂(纯化的抗Fc?II/III受体抗体)减少非特异性荧光染色； 对于人和兔细胞可以应用纯化同种的Ig或血清预先阻断Fc受体 对照的设置 细胞固定和膜穿透后，应用同一克隆的无荧光素结合抗体处理，能够区分细胞因子特异和非特异染色 荧光素结合的Isotype Ig作为阴性对照，阴性对照的抗体浓度应该与抗细胞因子抗体的浓度相同； 细胞内细胞因子检测,可设阳性对照细胞。 荧光补偿 流式细胞仪常用的荧光染料多数存在发射光谱的重叠，流式细胞仪的光学滤片系统最大限度地减少这些信号。 色彩补偿(Color Compensation):利用电子或数学方法从一个信号减少另外一个信号成分的技术，典型例子是校对一个波长区域的荧光信号在垂直轴的第二荧光的重叠。 多色荧光补偿的调节 两种发射荧光重叠的部分利用荧光(色彩)补偿调节来消除。 色彩补偿(Color Compensation):利用电子或数学方法从一个信号减少另外一个信号成分的技术，是校对一个波长区域的荧光信号在垂直轴的第二荧光的重叠。 设门的意义 细胞类型或亚型的鉴定 特殊蛋白质的分析 细胞的分选 细胞处理：细胞固定和膜通透,抗体滴度 检测细胞内的细胞因子表达，细胞必须在穿透细胞膜前被固定，以维持细胞的结构完整性； 细胞固定选用70%乙醇 4%(w/v) paraformaldehyde（中性pH, PBS缓冲液); 细胞穿透选用去污剂0.2%Triton X-100; 应用抗体标记的缓冲液含代谢抑制剂叠氮钠(0.09%w/v)，抑制抗体结合引起的细胞膜蛋白的再分布 由于荧光素结合抗体容易产生高水平的非特异背景信号，最好预先测定最佳抗体浓度，否则存在假阳性 流式细胞仪检测的生物学意义 免疫细胞的鉴定及表型分析 细胞表面蛋白质及细胞内因子含量的测定 细胞周期的分析 免疫细胞的鉴定及表型分析 免疫表型：利用荧光染料标记抗体识别细胞抗原 ，识别细胞亚群的标志。 白细胞簇分化抗原(Cluster Differentiation Antigen，CD)系统 1984年首届国际人类白细胞分化抗原会，对T细胞分化抗原命名，建立了CD命名系统