2-3-2 训 微生物诱发突变操作技术.pptVIP

;(一)实训目的 通过实验观察紫外线对枯草芽孢杆菌BF7658的诱变效应，并掌握物理诱变方法。 通过实验观察硫酸二乙酯为诱变剂对栖土曲霉的诱变效应，并掌握化学诱变方法。 ;(二) 实训原理 ; 紫外线诱变的主要作用是使DNA双链之间或同一条链上两个相邻的胸腺嘧啶形成二聚体，阻碍双链的分开、复制和碱基的正常配对，从而引起突变。紫外线照射引起的DNA损伤，可由光复活酶的作用进行修复，使胸腺嘧啶二聚体解开恢复原状。因此，为了避免光复活，用紫外线照射处理时以及处理后的操作应在红光下进行，并且将照射处理后的微生物放在暗处培养。 ;(三)材料和用具 枯草芽孢杆菌BF7658，栖土曲霉； 淀粉培养基、LB液体培养基 、察氏培养基、酪蛋白培养基； 碘液，无菌生理盐水，盛4.5ml无菌水试管。pH 7.2的0.1 mol／L磷酸盐缓冲液，Folin-phenol，0.55 mol／L Na2C03，10％三氯乙酸，2％酪蛋白溶液，酪氨酸溶液(100μg／mL) ； 无菌吸管，玻璃涂棒，血细胞计数板，显微镜，紫外线灯(15W)，磁力搅拌器，台式离心机，振荡混合器，无菌三角瓶，培养皿，试管，吸管，无菌脱脂棉，恒温水浴等。 ; (四)操作步骤 1．紫外线对枯草芽孢杆菌BF7658的诱变效应 （1）制备菌悬液 ①取培养48小时的枯草芽孢杆菌BF 7658的斜面4～5支，用无菌生理盐水将菌苔洗下，并倒入盛有玻璃珠的小三角瓶中，振荡30分钟，以打碎菌块。 ②将上述菌液离心(3000 r／min，离心10分钟），弃去上清液，将菌体用无菌生理盐水洗涤2次，最后制成菌悬液。 ;③用显微镜直接计数法计数，调整细胞浓度为108个/ml。 （2）制作平板 将淀粉琼脂培养基溶化后，冷却至45℃左右时倒平板，凝固后待用。 （3）紫外线诱变处理 ①将紫外线开关打开预热约20min。 ②取直径6cm无菌平皿2套，分别加入上述调整好细胞浓度的菌悬液3ml，分别置磁力搅拌器上。 ③开动搅拌器，打开板盖，在距离为28 cm，功率为15W的紫外灯下分别搅拌照射1 min和3 min。盖上皿盖，关闭紫外灯。 （4）稀释 用10倍稀释法把经过照射的菌悬液在无菌水中稀释成10-1～10-6。 ;（5）涂平板 取10-4、10-5、和10-6三个稀释度涂平板，每个稀释度涂3套平板，每套平板加稀释菌液0.1ml，用无菌玻璃涂棒均匀地涂满整个平板表面。以同样的操作，取未经紫外线处理的菌液稀释涂平板作为对照。 （6）培养 将上述涂匀的平板，用黑色的布或纸包好，置37℃培养48 h。注意每个平板背面要事先标明处理时间和稀释度。 ;（7）计数 将培养好的平板取出进行细菌计数。根据对照平板上CFU数，计算出每毫升菌液中的CFU数。同样计算出紫外线处理1 min和3min后的CFU数及致死率。 CFU代表“菌落形成单位”， CFU/mL指的是每毫升样品中含有的细菌群落总数。 （8）观察诱变效应 选取CFU数在5～6个左右的处理后涂布的平板观察诱变效应：分别向平板内加碘液数滴，在菌落周围将出现透明圈。分别测量透明圈直径与菌落直径并计算其比值 (HC比值)。与对照平板相比较，说明诱变效应，并选取HC比值大的菌落移接到试管斜面上培养，此斜面可作复筛用。 ;２．硫酸二乙酯对栖土曲霉菌株的诱变效应 （1）从长好的栖土曲霉斜面上取1环接种于大试管察氏培养基斜面上，33～34℃培养4天。 （2）制备孢子悬液 （3）硫酸二乙酯处理 （4）酶活力测定;（五）实训结果 （六）思考题 紫外线引起诱变作用的机理是什么?为保证诱变效果，在照射中及照射后的操作应注意哪些问题? 硫酸二乙酯作诱变剂应掌握哪些环节？