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蛋白质分离分析方法之四：——电泳技术2010.10 1.定义： ——带电离子在电场中的移动称为电泳。 在外电场的作用下，带电蛋白质颗粒将向旨与其电性相反的电极移动。电泳技术是分离不同分子混合物的常用实验技术。可用于氨基酸、肽、蛋白质、核苷酸和核酸等生物分子的分离分析和制备。 2. 影响蛋白质的泳动速度的因素： 内不因素——主要决定于它所带的净电荷量、颗粒的大小和形状。 外界因素——如溶液的pH值、离子强度、电场强度、温度等也会影响蛋白颗粒的泳动速度。 不同蛋白质的等电点分子大小和形状不同，在同一pH时带电荷数不等，因而其在同一电泳条件下的泳动速度不同因而可被分开。 若将带静电荷Q的离子置于电场中，它的受力简单分析如下： 电荷引力： F引＝EQ 根据Stokes公式，运动中的颗粒在溶液中受到阻力： F阻＝6π r η ν 平衡时，有 F引＝F阻，即 EQ＝6 π r η ν 整理后得： ν＝EQ/（6π r η） 式中：E——电场强度； r——球形粒子的半径； η——溶液的粘度系数； ν——带电粒子运动速度。 3。电泳分类 按照电泳时是否使用支持介质，可将电泳分为 界面电泳 区带电泳。 3.1 自由电泳在溶液中进行 方法是先在U-形管内使蛋白质溶液和缓冲液之间形成清晰的界面，然后加一电场(图)，界面就会移动，每个移动界面(峰)相当于某一特定的蛋白质。 由于界面处存在浓度梯度，利用适当的光学系统可以观察到界面(电泳照相谱中的峰)的移动，吸收峰的面积代表了蛋白质的含量。 3.2 区带电泳——在固体支持物上进行 按支持物的物理性状不同，区带电泳可分为: 滤纸电泳－在滤纸电泳； 薄膜电泳－如醋酸纤维薄膜电泳和聚酰胺薄膜电泳； 粉末电泳－支持介质是淀粉、纤维素粉或硅胶粉等，粉末与适当的溶剂调和铺设成平板； 细丝电泳－如尼龙丝和其它人造丝电泳，这是—类微量电泳； 凝胶电泳—如琼脂、琼脂糖、硅胶、淀粉胶、聚丙烯酰胺凝胶等 按支持物的装置形式不同，区带电泳可分为： 1) 平板式电泳，支持物水平放置，是最常用的电泳方式； 2) 垂直板式电泳，聚丙烯酰胺凝胶常做成垂直板式电泳； 3) 垂直柱式电泳，聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳即属于此类； 4) 连续液动电泳，首先应用于纸电泳，将滤纸垂直竖立，两边各放一电极，溶液自顶端向下流，与电泳方向垂直。后来有用淀粉、纤维素粉、玻璃粉等代替滤纸来分离血 清蛋白质，分离量最大。 凝胶电泳－最常用的介质有： （1） 聚丙烯酰胺凝胶（分离蛋白质） （2） 琼脂糖凝胶（分离核酸）。 这两种凝胶电泳的分辨率都很高。 另有：琼脂、硅胶、淀粉胶等 聚丙烯酰胺凝胶是分离蛋白质时最常用的凝胶，可以制作成平板或柱子（图）。故又称为平板凝胶电泳和柱状凝胶。 dodecyl sulfate polyacylamide gel electrophoresis ① SDS-蛋白质形成复合物，1.4克SDS与1克蛋白质结合，相当于每两个氨基酸残基结合一个分子的SDS。这样，蛋白质的原有电荷效应被覆盖，带有相同密度负电荷，分子量大小与迁移率成正比。 ② SDS改变蛋白质分子单体构象，全部变成似雪茄烟形的长椭圆棒型。 4. 电泳技术的应用： 电泳技术主要用于分离各种有机物（如氨基酸、多肽、蛋白质、脂类、核苷酸、核酸等）和无机盐；也可用于分析某种物质纯度，还可用于分子量的测定。 电泳技术与其他分离技术（如层析法）结合，可用于蛋白质结构的分析，“指纹法”就是电泳法与层析法的结合产物。用免疫原理测试电泳结果，提高了对蛋白质的鉴别能力。电泳与酶学技术结合发现了同工酶，对于酶的催化和调节功能有了深入的了解。所以电泳技术是医学科学中的重要研究技术。 4.1 纸电泳和醋酸纤维薄膜电泳 纸电泳用于血清蛋白质分离已有相当长的历史，在实验室和临床检验中都曾经广泛应用。自从1957年Kohn首先将醋酸纤维薄膜用作电泳支持物以来，纸电泳已被醋酸纤维薄膜电泳所取代。因为后者具有比纸电泳电渗小、分离速率快、分离清晰、血清用量少以及操作简单等优点。 4.2?? 琼脂糖凝胶电泳： 琼脂经处理去除其中的果胶成分即为琼脂糖。由于琼脂糖中硫酸根含量较琼脂为少，电渗影响减弱，因而使分离效果显著提高。 例如血清脂蛋白用琼脂凝胶电泳只能分出两条区带（α-脂蛋白、β-脂蛋白），而琼脂糖凝胶电泳可将血清脂蛋白分出三条区带（α-脂蛋白、前β-脂蛋白和β-脂蛋白）。所以琼脂糖为较理想的凝胶电泳的一种材料。 血清中的脂类物质与载脂蛋白结合成水溶性的脂蛋白形式存在，各种脂