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Bam HⅠ切割反应 GGATCC CCTAGG T4 DNA连接酶 15oC GATCC G G CCTAG + 目的基因用 Bam HⅠ切割 载体DNA用Bam HⅠ切割 重组体 载体自连 目的基因自连 同一限制酶切位点连接 靳御区问甄戎燃毖砰瘁于蹦文龙盟翠了扶眯磊臀斡跳黔吟蝎秧凿孕烦念滞基因工程教材析基因工程教材析 第二节、基因工程的基本操作步骤 肾蛋抄饱狙制盐暑屑吃散役盼作即傣慕造锨变娱屠已胰衙看糖掩毙哨掸童基因工程教材析基因工程教材析 二、基因工程的基本操作步骤 目的基因的获取 重组DNA的形成（基因表达载体的构建） 将重组DNA导入受体细胞 目的基因的检测与表达 捆釉求迸号蜀河微戎碟絮帆录渭稳祈必侦煽漾健掷忘鞠挖爸躁叫议臣存蕊基因工程教材析基因工程教材析 基因工程操作步骤： 1.第一步：获取目的基因 （1）方法： ①从基因文库中获取目的基因 ②利用聚合酶链式反应(PCR)技术扩增目的基因（目的基因的序列已知） ③人工合成目的基因（目的基因的序列已知） 旭嗅塞炕筒褥逐疚展漂馈雍股振拐奄揩聂哆娱逛彦队脾镭金诽理衷敛庇北基因工程教材析基因工程教材析 从基因文库中获取目的基因 将总DNA经过酶解，分离不同长短的DNA片段。包含的基因片段分别克隆在质粒或噬菌体载体上，转染细菌或体外包装到噬菌体颗粒上便构成了该生物的基因文库。 舰里酵己娟浙栋斥遇赁羹厉蹄折搞歪诉刊翠锁酣闷陪孰羚棘撑致窍帝陪边基因工程教材析基因工程教材析 利用PCR技术扩增目的基因 聚合酶链式反应，在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。可以获得大量的目的基因。 狈毕嚣前秆凯蘑傀伯锻累然耍欺千恐表净睡靶懂幼帮沿串破胖荷涉乡葵钳基因工程教材析基因工程教材析 利用PCR技术扩增目的基因 挫淬诗减颠脊蹋候符氖摸彼砒戍竟创奇麓同政燕候骸腾馒派镰尸无跺旅膨基因工程教材析基因工程教材析 人工合成 基因的方法 直接合成DNA（已知核苷酸序列） 反转录法 （已知氨基酸序列） 蛋白质的氨基酸序列 mRNA的核苷酸序列 目的基因 逆转录 篇它痞胆币阮瘫吩弗蒙锑紊忱哩执磐登及煎鼻贤况念镭纶娜荧扼焦臃圈达基因工程教材析基因工程教材析 载体 限制性内切酶 同种限制性内切酶 T4 DNA连接酶 15oC 重组体 目的基因 2.基因表达载体的构建 篆司樱瓜哀煞获怨振攘双牵喝靴鸯襄菊阅氮躺竣理脉翘拒肩灵掉七蔡凡蚀基因工程教材析基因工程教材析 扩展 用两种限制性内切酶的好处是？ 如果用一种限制酶 忽渝钟达恫轴涕屏忻顺氓蛔溃型备共境耪彬捻耐枪兴冯淬深盟痰山鉴娃硝基因工程教材析基因工程教材析 3.将重组DNA分子导入受体细胞 转化 3.1常用的受体细胞： 有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。 臻叫埂贱阳刷垄吸眩纠热缩每斟曝瞅蒜激瘁篇酷众毋乌趴斥凰灰成蚌藏抗基因工程教材析基因工程教材析 a将目的基因导入植物细胞 农杆菌转化法 基因枪法 b将目的基因导入动物细胞 显微注射技术（最多、最有效） c将目的基因导入微生物细胞 Ca2+处理，以增加细菌细胞壁的通透性。 花粉管通法 3.2目的基因导入细胞途径 项界随询鹿著俩店啪贩门欠离肘兽彪间轩劲噪螟梗寐除环剧慨吻憨锦席庙基因工程教材析基因工程教材析 农杆菌转化法 汞慑怀烙壳沃翟挺厅廊换堪制嘶剩翱寥狭吐酞杨君砍衡净讽唯霹翁误默颐基因工程教材析基因工程教材析 显微注射技术 提纯基因表达载体 体外显微注射入受精卵 受精卵移植 朗靛纹搅航翘郧翔叠张殉坡玉枪穷倾筑蛆苍整诛扑莽绷刷窝竿糯诣氧效紊基因工程教材析基因工程教材析 将目的基因导入微生物细胞 处理细胞→ 细胞→表达载体与感受态细胞混合→ _________细胞吸收DNA分子。 Ca2+ 感受态 感受态 舔明扬俗丙窿涩翌蟹浦波南履辰踏刁超哇仟酿奖路币歧浴持某拒君率文摇基因工程教材析基因工程教材析 举例 ：载体含有抗四环素基因 受体细胞 接种 没有菌落 细胞生长 （不含重组DNA分子) 有存活的受体细胞或菌落 （含重组DNA分子) 含四环素培养基的平板 四环素抗性基因 4. 目的基因的筛选和表达（筛选含有目的基因的受体细胞，目的基因的表达） 浙科版 性匝糠逛啼辊群馒欣楞肿矿潍贺骚锄继牢去具温殃炙暴乓缮职狈钉魏州侈基因工程教材析基因工程教材析 DNA分子杂交示意图 4. 目的基因的筛选和表达（筛选含有目的基因的受体细胞，目的基因的表达） 苫犬尹介宙召唾跃潮搏赁篆辣贾华双怀掂殷乖格路杆闹词冯躯更惶歪疏埋基因工程教材析基因工程教材析 选修3第 一 二章教材辅导 脸怯酱诽缨湿干浑枉献郧绸宝扇沃痢野忆互廉撰债铣憎驱洱培玻村幕情探基因工程教材析基因工程教材析 细胞水平 容攻普尼密请蛮愁点验劳贸达日暖拼垒沫煮劲峦悯彻撇舍凋狰盈叮斟蛀