农产品分析蛋白质测定-3-1.pptxVIP

1 第五章 蛋白质的测定 2 蛋白质的测定方法 pro的测定方法分为两大类： 一类是利用pro的共性，即含氮量，肽链和折射率测定pro含量; 另一类是利用蛋白质中特定氨基酸残基、酸、碱性基团和芳香基团测定pro含量。 蛋白质用凯氏法测定，因其中尚有氨基酸、酰氨等非蛋白质氮，故称“粗蛋白质”，若用重金属盐等沉淀分离以后，进行全氮测定，由氮换算成的蛋白质含量，则称为“纯蛋白质”。 3 测定蛋白质最常用的方法为凯氏定氮法 凯氏定氮法是通过测定出样品中的总氮含量再乘以相应的蛋白质系数而求出蛋白质的含量。经过人们长期的应用和不断改进，凯氏定氮法已演变成常量法、微量法、半微量法、改良凯氏法及自动定氮法等。 4 优点： 具有应用范围广、灵敏度高、回收率好及不需昂贵仪器等优点。 缺点： 操作较费时(除自动凯氏定氮法外)，单消化过程一般就需要2～3h，如果遇到高脂肪、高蛋白样品消化需要5h以上；在操作过程中会产生大量有害气体。 5 为满足生产单位对工艺过程快速控制分析，减少环境污染和操作简便省时，后来在凯氏定氮法的基础上又陆续出现了水杨酸比色法、双缩脲法、水合茚三酮法、染料结合法、紫外分光光度法、折光法、旋光法、近红外线光谱法以及测定开氏消煮液中铵的靛酚蓝法和纳氏比色法。 6 重点介绍凯氏定氮法、染料结合法、双缩脲法 三种方法。 测定氨基酸主要的方法是利用氨基酸自动分析仪、茚三酮法、染料结合法、乙醛酸法、荧光法等。 重点介绍氨基酸自动分析仪法测定全氨基酸、染料结合法测定赖氨酸及乙醛酸法测定色氨酸。 7 粗蛋白质的测定 凯氏定氮法 这种方法是1883年丹麦人开道尔(J·Kjeldahl)发明，当时凯氏只使用H2SO4来分解试样，来定量谷物中的pro，他只知用H2SO4分解试样，而不能阐明H2SO4分解有机氮化合物生成氨的反应历程，所以只使用H2SO4分解试样，需要较长时间，后来由Gunning进行改进，他是在消化时加入K2SO4使沸点上升，这样加快分解速度，因为温度由原来硫酸沸点的330℃上升到400℃，所以速度也就加快了，凯氏定氮法至今仍在使用。 8 优点：具有应用范围广、灵敏度高、回收率好及不需昂贵仪器等优点。缺点：操作较费时(除自动凯氏定氮法外)，单消化过程一般就需要2～3 h，如果遇到高脂肪、高蛋白样品消化需要5 h以上；在操作过程中会产生大量有害气体。 9 我们在检验农产品中pro时，往往只限于测定总氮量，然后乘以pro核算因数，得到蛋白质含量，实际上包括氨基酸、酰氨、核酸、生物碱、含氮类脂、卟啉和含氮色素等非蛋白质含氮化合物，故称为粗pro。 如果蛋白质用重金属盐等沉淀分离以后，进行全氮测定，由氮换算而成的蛋白质的含量，则称为“纯蛋白质”。 10 （一）方法原理 氮素是蛋白质中的主要成分。同类植物蛋白质的含氮量基本上是固定的。因此，可将测得含氮值乘以换算因数，即得蛋白质含量。 11 样品与硫酸和催化剂一同加热后消化，使蛋白质分解，其中的碳和氢分别被氧化成二氧化碳和水逸出，而有机氮转化成氨后与硫酸结合生成硫酸铵，然后在碱性条件下蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后再用硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即得蛋白质含量。该过程的反应方程式表示如下： 12 消化：2NH2(CH2)2COOH + 13H2SO4 (NH4)2SO4 + 6CO2↑+ 12SO2 + 16H2O 蒸馏：(NH4)2SO4 + 2NaOH 2NH3↑+ Na2SO4 + 2H2O 吸收：2NH3 + 4H3BO3 (NH4)2B4O7 + 5H2O 滴定：(NH4)2B4O7 + 2HCl + 5H2O 2NH4Cl + 4H3BO4 13 在消化过程中，为了加速蛋白质的分解，缩短消化时间，常加入硫酸钾、硫酸铜等物质。加入硫酸钾可以提高溶液的沸点而加快有机物分解，因为它与硫酸作用生成硫酸氢钾可提高反应温度。但其加入量不能太大，否则消化温度过高，又会引起已生成的铵盐发生热分解放出氨而造成损失。 14 （二）操作步骤 1、蛋白质的沉淀 2、蛋白质的消煮 3、氮的测定 15 样品 （0.5mm） 沸水 取下放置30分钟 1、蛋白质的沉淀 △ 沸 腾5min CuSO4溶液 NaOH溶液 ？ 放置半至1小时 倾泻法过滤 沉淀 沸水洗涤 烘干 60℃ 16 2、蛋白质的消煮 沉淀 浓H2SO4 放置2小时或过夜 1︰10的CuSO4︰K2SO4 小火加热 加大火力 至无色透明 冷却 后煮30min 电炉 消煮