第五章动物细胞融合与单克隆抗体技术.pptVIP

第五章 动物细胞融合与杂交 一、概念 细胞融合：两个或两个以上相同的细胞合并形成一个细胞的过程。 细胞杂交：两个或两个以上不同的细胞合并形成一个细胞的过程，包括种内杂交和种间杂交。 二、原理 细胞融合过程可分为： 凝集：细胞凝集与细胞膜的糖蛋白有关 蛋白质分子重新分布：是细胞融合的必要前提 脂质分子重排：是实现细胞融合的关键 胞质合并：后续的稳定步骤。 2.化学融合剂诱导融合（P107） 3.电融合技术 电融合的特点 ①融合频率高，对细胞伤害小 ②正弦交变电场对细胞的长时间作用会损伤细胞 ③非特异性融合 三、细胞融合方法 4. 激光诱导细胞融合 （1）原理： 光镊所形成的光学势阱会把细胞拉向光束中心，钳住细胞，从而实现了对生物粒子的远距离、非接触式捕获。 （2）特点： 可对单个核细胞进行操作，但设备昂贵，操作技术要求高。 （二）细胞融合的方法 5. 微流控芯片的细胞融合技术 （1）原理： 将微通道网络整合到生物芯片上，使得微流控系统成为细胞融合的理想平台 （2）特点： 实现大量单个成对细胞的融合 6.细胞融合的影响因素 细胞的种类和性质 细胞表面性质 细胞种类 亲本细胞的亲缘关系 融合温度及PH等环境条件 离子强度及离子种类 四、 融合子检出的选择系统 遗传互补选择 营养缺陷型互补选择 抗性互补选择 形态特征互补选择 生长特性选择 五、融合子的鉴定方法 细胞学鉴定：染色体数目，形态结构 生化分析：同工酶谱为双亲的总和 分子生物学鉴定：DNA探针 六、细胞融合技术的应用 基因定位和人类基因图谱绘制 肿瘤免疫的研究：肿瘤树突状细胞疫苗 单克隆抗体的生产 动物新品种的培育 5.2 杂交瘤技术 一、B淋巴细胞杂交瘤技术 原理：细胞融合+克隆选择理论 免疫球蛋白的单体分子结构 2.饲养细胞的制备及作用 饲养细胞的作用： 提高培养细胞的密度，使待克隆细胞容易生存与繁殖。 腹腔细胞能清除培养中的死亡细胞，从而促进单个细胞克隆的生长。 饲养细胞能释放诸如细胞生长因子类物质，起到促进细胞分裂、增殖的作用。 酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) 间接免疫荧光法(Indirect immunofluorescence, IFA) 放射免疫法(radioimmunoassay, RIA) 双相扩散法 7. 杂交瘤细胞的冻存与复苏 目的：保种 方法：离心收集杂交瘤细胞悬液，用含10％DMSO和10％FBS的培养基调整细胞密度，若短期保存，可置-80度冰盒中；若长期保存，则从冰盒转入液氮中。 复苏：如果冻存的细胞是来自96孔板的一孔，复苏后也应接种到96孔板的一个孔中 8.单克隆抗体的规模化生产 主要有两种方法 （1）体外法：用人工反应器大量培养杂交瘤细胞 （2）体内法：用生物体作为细胞反应器大规模培养杂交瘤细胞 9.融合后杂交瘤不生长的原因分析： 聚乙二醇有毒 小牛血清的质量有问题； 支原体污染 HAT有问题 10.杂交瘤细胞不分泌抗体或停止分泌抗体原因分析 融合后经HAT选择有细胞克隆出现，但不能筛选出产生特异抗体的杂交瘤，常见原因是： 抗体检测法不够敏感 HAT选择失败 动物免疫不成功 染色体丢失和克隆竞争　 三、T淋巴细胞杂交瘤 概念：T淋巴细胞亚群经有丝分裂原刺激后能分泌多种淋巴因子。将之与胸腺瘤或淋巴瘤BW5147株融合而建立的T淋巴细胞杂交瘤株。 淋巴因子：干扰素、白细胞介素2、巨噬细胞激活因子等 四、抗体的发展现状 人鼠型杂交瘤：人淋巴细胞+鼠骨髓瘤细胞 问题：易丢失人染色体 人型杂交瘤：人淋巴细胞+人骨髓瘤细胞 问题：①尚未获得理想的瘤系， ②建株困难，抗体产量太低等 2.鼠源单克隆抗体 鼠衍生杂交瘤： 问题：①出现人抗鼠抗体反应 ②鼠抗体不能有效激活人免疫系统 (1)抗体DNA重组 通过基因工程技术用人蛋白取代鼠抗体的恒定区，仍保留鼠蛋白在抗体中的可变区，形成约含有65%人蛋白的嵌合抗体。 问题：含有一定量的鼠蛋白，亲和力差，产量低，纯化费用高，临床效果差 人－鼠嵌合抗体 3.基因工程抗体 (2)噬菌体表达技术 用体外基因克隆技术将B细胞全套可变区基因克隆出来，插入噬菌体表达载体，转化工程细菌进行表达。 问题： ①没有经过天然抗体成熟，亲和力低 ②需要相当复杂的抗体基因技术和多轮筛选才能获得。 3.基因工