核酸分子杂交技术 核酸分子杂交的基本原理与分类.pptVIP

3、全程RNA探针标记4、化学法全程标记 四、杂交与杂交后检测 （一）核酸分子与固相介质的结合 1、支持介质的类型和性质 硝酸纤维薄膜： 本底低，易检测杂交信号对小于500碱基的 核酸结合力低，脆性大易破裂。 尼龙膜和带电荷的尼龙膜： 耐用，结合力强，但其本底高。 （二）核酸分子的转移 1、噬菌体/克隆的转移 2、从凝胶上转移DNA （1）毛细转移 （2）真空转移 （3）电转移 （三）核酸的固定 1、烘烤 80℃2小时 2、紫外光固定 3、碱固定 （四）杂交 1、预杂交 （1）目的：减少非特异性杂交 （2）成分： 去污剂：1%SDS （可促进溶液对薄膜的覆盖，可 抑制RNase酶活性） 封闭剂：Denhard氏溶液 2、杂交 影响杂交的因素 （1）影响长探针杂交的因素 1）影响杂交速率和杂化分子稳定性的因素 ◇核酸分子浓度与杂交速率 ◇高浓度双链探针的杂交 ◇碱基组成：探针的Tm高，杂交速率快 ◇盐浓度：离子强度与杂交速率成正比；与杂交稳定性 也成正比。 ◇温度：与杂交速率成正比。 ◇甲醛：可降低Tm值。 ◇错配的核酸序列：错配降低杂交速率。 ◇杂交的加速剂 影响长探针杂交的因素 2）酶联探针 3）杂交反应体积 4）杂交时间 3、洗脱 除去溶液 未反应的探针 与滤膜疏松结合的探针 非特异性结合的探针 （五）杂交信号的检测 放射自显影 非放射性杂化分子的检测 4、点杂交和狭缝杂交 （四）基因芯片技术 是集成化的核酸分子杂交技术。 （1）5’端标记法（T4噬菌体多苷酸激酶）  用碱性磷酸酶切除DNA双链分子或RNA单链5’末端的磷酸基团，使其成为5’-OH，然后在（γ-32P）ATP存在下，经T4噬菌体多苷酸激酶催化，将γ位上的32P转移到DNA或RNA分子的5’-OH末端，使DNA片段或RNA或寡核苷酸5’端均带32P标记。 T4噬菌体多苷酸激酶催化 （2）3’端标记法（大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow片段） 大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow片段有5’→3’DNA聚合酶和微弱的3’→5’外切酶活性，但无5’→3’外切酶活性。对残缺3’末端可进行标记。   35kD 76kD 苦草杆菌蛋白酶裂解全酶 5’ 3’外切酶 5’ 3’聚合酶 3’ 5’外切酶 5’ 3’聚合酶 3’ 5’外切酶 Klenow片段 DNA聚合酶I全酶 五、分子杂交技术 液相杂交、固相杂交、原位杂交、基因芯片（一）液相分子杂交 将参加液相杂交的两条核酸链都游离在溶液中，在一定条件下（溶液的离子强度、温度、时间等）进行杂交，然后再将未杂交的探针除去，即得到杂交后的核酸分子。 （二）固相分子杂交 将待测的靶核苷酸链预先固定在固体支持物上，而标记的探针则游离在溶液中，进行杂交反应后，使杂交分子留在支持物上，故称固相杂交。其可通过漂洗能将未杂交的游离探针除去，留在膜上的杂交分子容易被检测，能防止靶DNA的自我复性，故被广泛应用。 1、菌落杂交 用于重组细菌克隆筛选的固相杂交。主要步骤： 菌落平板培养 滤膜灭菌后放到细菌平板上 菌落粘到滤膜上 滤膜放到杂交液中 探针杂交 检测 2、 Southern印迹杂交 膜上检测DNA的杂交技术，1975年由Edwin Southern建立。利用这一技术可进行克隆基因DNA的酶切图谱分析，基因组中某一基因的定性与定量分析、基因点突变及限制性片段长度多态性分性等。 * * 第九章 核酸分子杂交技术与应用 第一节 杂交的基本原理一、核酸分子杂交的基本原理与分类（一）核酸分子杂交的基本原理1、变性（denaturation）（1）定义： 在一定的条件下，双螺旋之间氢键断裂，双螺旋解开，形成无规则线团，双链解链成为单链。 （2）.引起核酸变性的因素 酸 碱 热 变性剂 （尿素） 有机溶剂 （乙醇） ???????????????????????????????????????????????????????????????????????? （3）、变性核酸的特点： 粘度下降 沉降速度增加 浮力上升 紫外吸收增加  2、融解温度：定义：在DNA热变性时，其A260的升高达最  大值一半