实验指导-微生物纯化与分离.PDF

第六部分 微生物分离与纯化技术 在自然条件下，微生物常以群落状态存在。群落是不同种类微生物的混合体。要研究某种微生物的特 性或者要大量培养和使用某种微生物，必须从这些混杂的微生物群落中获得所需微生物的纯培养物。这种 获得纯培养物的方法称为微生物的分离纯化技术。 分离纯化技术主要由采取样品、富集培养、纯种分离和性能测定四个环节组成。采取样品：主要依据 目的菌的生态分布，决定采样地点。富集培养：主要依据目的菌的生理特性，加入某些特定物质，使需要 的微生物增殖，造成数量上的优势，限制不需要的微生物增殖。纯种分离：常用的方法有 10 倍稀释平板分 离法、平板涂布法、平板划线法、单细胞分离法等。性能测定：测定目的菌的性能，并据此进行初筛和复 筛。 下面重点介绍采用 10 倍稀释平板分离法、平板涂布法和平板划线法，从土壤中分离细菌、放线菌和真 菌的程序。 实验1 从土壤中分离微生物 一、目的要求 1、了解平板划线法分离微生物的原理。 2、初步掌握从土壤中分离细菌的基本技术。 二、实验原理 土壤是微生物生活的大本营，是寻找和发现具有重要价值微生物的主要菌源。在不同土壤中，各类微 生物的数量千差万别。为了分离获得某种微生物，需要预先制备不同稀释度的菌悬液，并添加相应的抗生 素抑制不需要的微生物，例如，添加链霉素 25～50U/mL 抑制细菌；添加 0.5 ％重铬酸钾液或制霉素 50U/mL 抑制霉菌。通过 10 倍稀释以及平板分离、平板涂布和平板划线等操作，微生物可在平板上分散成单个的个 体，经过适宜条件培养，单个个体可形成单个菌落。挑取单个菌落转接至新鲜平板上，即可使目的菌种纯 化。 三、实验器材 1、菌源：选定采取土样的地点后，铲去表土层（2～3cm ），取深层（3～10cm）土壤 10g，装入无 菌牛皮袋内，封好袋口，并记录取样地点、环境特征和详细日期。取回土样后，及时分离菌种，若不能及 时分离，将土样保存在低温、干燥的条件下，尽可能减少菌相变化。 2、培养基（10mL 装）：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，淀粉琼脂培养基，马铃薯蔗糖培养基。 3、无菌水：在250mL 锥形瓶中，灌装 45mL 蒸馏水，放入 10 粒玻璃珠；在 5～7 支试管中灌装 9mL 蒸馏水，灭菌备用。 4 、试剂：5000U/mL 链霉素液；0.5％重铬酸钾液或 50U/mL 制霉素。 5、其它用品：无菌培养皿，无菌移液管，无菌三角玻棒，接种环，酒精灯，火柴，特种铅笔，标签 纸，胶水，天平，恒温水浴锅，恒温培养箱。 四、实验程序 （一）制备土壤稀释液 1、制备土壤悬液 称取5g土壤，在火焰旁放入装有45mL无菌水的锥形瓶中，振荡10min，使 -1 土样中的菌体、芽孢或孢子均匀分散，制成稀释度为10 的土壤悬液（图17-1）。 图17-1 土壤稀释液的制备 2、制备土壤稀释液 -2 -3 -4 -5 -6 另取6支装有9mL无菌水试管，用特种铅笔编上10 、10 、10 、10 、10 、 10-7 -1 ，放在试管架上。让制好的10 土壤悬液静止0.5min，取1支无菌移液管， 从移液管包装纸上半段（近吸管口）撕口，将包装纸分成上下两段，去上段包装 纸，左手持锥形瓶底，以右手掌及小指、无名指夹住锥形瓶上棉塞，在火焰旁拨 出棉塞（棉塞夹在手上，不得放在桌面上），去下段包装纸，将移液管吸液端伸 进锥形瓶内，吸取1mL土壤悬液（常用嘴巴吸取，也可用定量移液器或自动移液 器吸取，图17-2），右手将棉塞插回锥形瓶上，左手放下锥形瓶，换持编号为 10-2 的无菌水试管，在火焰旁拨出棉塞（试管盖），将移液管伸进无菌水试管内，