外植体培养及幼胚拯救.PDF

外植体消毒步骤： 1、 花蕾、花瓣、叶片的消毒：取未开放的小花蕾，花苞的里层花 瓣，幼嫩的叶片置清水中洗两到三遍，在无菌条件下，用 75％ 的酒精消毒 30S，用 0.1％的升汞消毒 8min，用无菌水冲洗 4-5 遍，在整个灭菌和清洗过程中，应不停地摇动瓶子，使材料充 分与消毒液和清洗液接触。然后将材料接到培养基上。 2、 脚芽的消毒:取 3cm 左右的脚芽，去掉展开的叶片，将材料置 清水中洗两到三遍，在无菌条件下，用 75％的酒精消毒 30S， 用 0.1％的升汞消毒 4min 左右，用无菌水冲洗 4-5 遍，在整 个灭菌和清洗过程中，应不停地摇动瓶子，使材料充分与消毒 液和清洗液接触。然后将材料接到培养基上。 幼胚拯救实验步骤 1、 授粉后 15-18d （以第2 次为止，ps：第 2 次隔第 1 次 1-2d)， 将其花序取回实验室里 （自封袋+少量水） 2、 将小花用镊子轻剥下，放入双层纱布包裹 （不松不紧为宜）， 等待幼胚拯救 3、 将加有 6-BA：NAA=2：0.5MS 培养基连同 5 瓶水 （灭过菌）、 培养皿、剪刀、解剖针、镊子放入组培台中，组培台内配置同 常规 4、 将一个灭过菌的空三角瓶 （500ml）待灭菌结束后打开，装入 包裹好的纱布中，加入 75%酒精，摇晃 30s，放入组培台中， 30s 过后，将酒精倒出，1）加入升汞 （0.1%），灭菌 4min30s； 或 2）加入双氧水 （15%），灭菌 10min；不停摇晃直至结束， 将灭菌结束后的纱包用镊子夹出，取一瓶灭菌水将其加入，不 停摇晃清洗 2min，结束后用镊子夹入放入第二瓶水中 3min， 再次重复，第 3 瓶水 4min，第 4 瓶水 5min，第 5 瓶水 5min， 然后，点燃酒精灯 5、 取出培养皿 （盖+带滤纸），此期间，将剪刀，镊子，解剖针 烧 3 次，并取出最后水洗过的纱包，放入培养皿盖中，用剪刀 剪开纱布，开始幼胚拯救 6、 取一滤纸作工作台，用镊子夹取适量小花，放到滤纸上，用镊 子与解剖针剥出胚珠，集齐一定数量胚珠，以第一胚珠不干不 燥为准，将其放入培养基 （少量）。重复此操作，直至结束， 记号笔表明放入培养室培养。 PS：关于消毒剂的类别和灭菌时间，视具体情况而定，