蛋白质含量测定及血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳l.pptVIP

蛋白质含量的测定及血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳 一、目的 掌握考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量的原理和方法 了解分光光度计的使用方法 掌握醋酸纤维薄膜电泳法分离蛋白质的原理和方法； 了解血清中各种蛋白质成分。 1.考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量 考马斯亮蓝G-250在游离态下呈红色，当它与蛋白质的疏水区结合后变为青色，前者最大光吸收在465nm，后者在595nm。 在一定蛋白质浓度范围内（0～100μg/ml），蛋白质－色素结合物在595nm波长下的光吸收与蛋白质含量成正比。故可用于蛋白质的定量测定。 蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速，其结合物在室温下1h内保持稳定。 该反应非常灵敏，可测微克级蛋白质含量，所以是一种比较好的蛋白质定量法。 二、原理 Coomassie Dye-Based 蛋白质定量 PROTEIN + Amax = 595nm BLUE Acid Coomassie G-250 Protein - Dye Complex O CH 2 CH 3 NH C CH 3 CH 3 N CH 2 SO 3 - CH 3 CH 2 N CH 2 CH 2 CH 3 SO 3 Na + １．利用标准管计算待测物含量 用已知浓度的标准物与待测物同样处理显色，读取吸光度值，再根据A=εbc计算：A1=ε1b1c1 A2=ε2b2c2 　　　　　　 b1=b2 ε1=ε2 　　　　　　c2=(A2/A1)*c1 A为测得的吸光度；b为比色杯径长；c为浓度。 分光光度技术的应用 ２．利用标准曲线进行换算 先配制一系列已知浓度的标准溶液，按与待测物同样方法处理显色，分别读取各管吸光度值，以各管吸光度为纵坐标，各管溶液浓度为横坐标，在坐标纸上作图得标准曲线，以待测物吸光度从标准曲线上可求得待测物的浓度。 ３．利用摩尔吸光系数ε，求待测物浓度 ε=A/bc 当比色皿内径为1cm时，公式转化为 c=A/ε；ε为摩尔吸光系数。 血液凝固后析出淡黄色透明液体为血清，血浆蛋白质分为清蛋白和球蛋白两大类。 醋酸纤维素薄膜具有匀一的泡沫状结构，渗透性强，对分子移动无阻力，具有用样量少，分离清晰，无吸附作用等优点。目前可用于血清蛋白、脂蛋白、糖蛋白、酶的分离和免疫电泳等方面。 醋酸纤维素薄膜经1,4－二氧六环、透明液或液体石蜡处理即透明，因而可得背景为无色的电泳图谱。 2. 血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳 电泳 带电质点(分子、离子、胶体颗粒)在电场作用下向带相反电荷的电极移动的现象。 等电点 蛋白质分子所带带正负电荷恰好相等净电荷为零时的pH值称为蛋白质的等电点（PI）。 pHpI 蛋白质带负荷，电场中向阳极移动 pH=pI 电场中不移动，蛋白质沉淀出，此时导电率、渗 透压、粘度等均达最低值。 pHpI 蛋白质分子带正电荷，电场向阴极移动。 各种 Pr 分子在不同的 pH 条件下的带电情况不同。Pr 对环境 pH 的“感受”取决于它的 pI值。 pI＞pH 时，Pr 感觉“酸”，此时它产生正电荷； pI＜pH时，Pr 感觉“碱”，此时它产生负电荷。 在这次实验的pH条件(8.6)下，所有蛋白质均带负电荷—在电场中向阳极移动。 血清蛋白质能与染料氨基黑10B结合而显色。 血清蛋白 蛋白质名称 等电点（pI） 迁移率[cm2/(V*s)] 分子质量 　　清蛋白 α1－球蛋白 α2－球蛋白 β－球蛋白 γ－球蛋白 4.88 5.06 5.06 5.12 6.85~7.5 -5.9*10-5 -5.1*10-5 -4.1*10-5 -2.8*10-5 -1.0*10-5 69000 200000 300000 90000~150000 156000~300000 迁移率：带电颗粒在电场强度作用下泳动的速度。Ｕ＝v/E 其泳动顺序为清蛋白α1α2βγ。 三、材料，仪器和试剂 1 材料 猪血清 2 仪器 722型分光光度计 稳压电泳仪 水平电泳槽 点样器 醋酸纤维薄膜(8X2mm) 染色皿 漂洗器 镊子 粗滤纸 直尺和铅笔等 3 试剂 巴比妥-巴比妥钠缓冲液（pH8.6，0.07mol/L) 染色液：取氨基黑10B 0.25g，加入甲醇（A.R.）50mL， 冰乙酸（A.R.）10mL和蒸馏水40mL配制 漂洗液：95%乙醇45mL，冰乙酸5mL和蒸馏水50mL混匀 透明液：（临用前配制）将30mL冰乙酸和无水乙醇70mL混匀而成。