蛋白质含量的测定及醋酸纤维薄膜电泳2009.11.pptVIP

2009.11 实验目的 了解血清中各种蛋白质成分。 学会常用电泳的使用方法。 掌握醋酸纤维薄膜电泳法分离蛋白质的原理和方法。 了解用醋酸纤维薄膜作支持物的优点及使用范围。 掌握考马斯亮蓝染色法测定蛋白质含量的原理。 血液是由血浆及混悬其中的红细胞,白细胞及血小板组成。 血液凝固后析出淡黄色透明液体为血清,血清中没有纤维蛋白原,但含有一些在凝血过程中生成的分解产物。 最简单的是将血浆蛋白质分为清蛋白和球蛋白两大类。 2 　实验原理 2.１　相关知识 电泳 带电质点(分子、离子、胶体颗粒)在电场作用下向带相反电荷的电极移动的现象。 等电点 蛋白质分子所带带正负电荷恰好相等净电荷为零时的pH值称为蛋白质的等电点（PI）。 迁移率 带电颗粒在电场强度作用下泳动的速度。 　pH大于pI，蛋白质带负荷，电场中向阳极移动 　pH=pI，电场中不移动，蛋白质沉淀出，此时导电率、　　　　　　　　　渗 透压、粘度等均达最低值。 　 pH小于pI， 蛋白质分子带正电荷，电场向阴极移动。 各种 Pr 分子在不同的 pH 条件下的带电情况不同： 2.2 醋酸纤维素薄膜电泳原理 该膜具有均一的泡沫状结构（厚约120μm），渗透性强，对分子移动的阻力很弱。 作支持物进行电泳，具有微量、快速、简便、分离清晰、对样品无吸附现象等优点。 现已广泛用于血清蛋白、糖蛋白、脂蛋白、血红蛋白、酶的分离和免疫电泳等方面。 　因各种血清蛋白质的等电点在pＨ7 以下，故在pＨ8.6 的缓冲液中带负电，在电场中向阳极泳动。 血清蛋白 69000 200000 300000 90000~150000 156000~300000 分子质量 蛋白质名称 等电点（pI） 迁移率[cm2/(V*s)] 相对百分含量 （%） 　　清蛋白 α1－球蛋白 α2－球蛋白 β－球蛋白 γ－球蛋白 4.88 5.06 5.06 5.12 6.85~7.5 -5.9*10-5 -5.1*10-5 -4.1*10-5 -2.8*10-5 -1.0*10-5 54~73 2.78~5.1 6.3~10.6 5.2~11 12.5~ 20 血清蛋白质能与染料氨基黑10B结合而显色。 按电泳速度分为5条区带，从正极端依次为清蛋白、α1球蛋白、α2球蛋白、β球蛋白及γ球蛋白。经染色、比色，可算出各部分蛋白质的相对百分含量。 2.3 　考马斯亮蓝染色法测定蛋白质含量的原理 考马斯亮蓝G-250在游离态下呈红色，当它与蛋白质的疏水区结合后变为青色，前者最大光吸收在465nm，后者在595nm。 在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质－色素结合物在595nm波长下的光吸收与蛋白质含量成正比。故可用于蛋白质的定量测定。 蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速，其结合物在室温下1h内保持稳定。 该反应非常灵敏，可测微克级蛋白质含量，所以是一种比较好的蛋白质定量法。 Coomassie Dye-Based 蛋白质定量 PROTEIN + Amax = 595nm BLUE Acid Coomassie G-250 Protein - Dye Complex O CH 2 CH 3 NH C CH 3 CH 3 N CH 2 SO 3 - CH 3 CH 2 N CH 2 CH 2 CH 3 SO 3 Na + １．利用标准管计算待测物含量 用已知浓度的标准物与待测物同样处理显色，读取吸光度值，再根据A=εbc计算：A1=ε1b1c1 A2=ε2b2c2 　　　　　　 b1=b2 ε1=ε2 　　　　　　 c2=(A2/A1)*c1 A为测得的吸光度；b为比色杯径长；c为浓度。 2.4 分光光度技术的应用 ２．利用标准曲线进行换算 先配制一系列已知浓度的标准溶液，按与待测物同样方法处理显色，分别读取各管吸光度值，以各管吸光度为纵坐标，各管溶液浓度为横坐标，在坐标纸上作图得标准曲线，以待测物吸光度从标准曲线上可求得待测物的浓度。 ３．利用摩尔吸光系数ε，求待测物浓度 ε=A/bc 当比色皿内径为1cm时，公式转化为 c=A/ε；ε为摩尔吸光系数。 以样品测定的吸光值在标准曲线上查出对应的蛋白质含量（mg/ml），乘以样品稀释倍数，即得样品蛋白质含量。 蛋白质含量( mg) 吸光度 3 实验仪器、材料与试剂 1 仪器 稳压电泳仪 水平电泳槽 点样器 醋酸纤维薄膜(8X2mm) 染色皿 漂洗器 镊子 粗滤纸 直尺和铅笔等 分光光度计 2 试剂 巴比妥-巴比妥钠缓冲液（pH8.6，0.07mol/L) 染色液：取氨基黑10B 0.25g，加入甲醇（A.R.）50mL， 冰乙酸