HGH质量检定实验.doc

产品质量研究 对于rHGH产品的质量研究贯穿整个实验室研究、中试研究过程，并对工艺各阶段进行严格的质量控制，确保产品的高质量。 对中试产品的质量控制分两方面进行：1. 半成品/成品的质量控制；2. 成品的质量控制。均严格按照《中国生物制品检定规程》（2000版）中各相关规定与程序进行。 一．产品质量研究 半成品质量检定 1.1免疫印迹试验： 用鼠抗人的HGH单克隆抗体（Neomarkers公司）对rHGH进行western blot分析。结果见图1，rHGH显示强阳性。 (a) (b) 图1. rHGH表达SDS及western-blotting图 （a）：SDS胶　 （b）：Western blotting膜 M: Marker ； 1.2.3 HGH原液冻干品 1.2紫外光谱扫描：根据《中国生物制品检定规程》（2000版）中“紫外光谱测定”的具体方法进行。将纯化样品用生理盐水稀释到0.5mg/ml，加入1cm石英吸收池内，在220-300nm波长范围内扫描样品。 图2－1 批号rHGH扫描图 图2－2: 号rHGH半成品扫描图 同时还扫描另外2个批号半成品，特征波长如下： 样品 特征峰波长nm 吸光值 279 0.42417 279 0.41222 279 0.43200 可见，本产品蛋白质特征峰在277±3nm范围内 1.3 纯度及分子量检测 a. sds电泳：用非还原型SDS法，SDS法，加样量不低于5μg10μg（考马氏亮蓝R-250染色法），经’’ 图3－1.半成品还原、非还原SDS电泳 Marker 2012011批号rHGH还原处理 2012011批号rHGH非还原处理 b’ . 2012012批号rHGH还原处理 c’ 2012012批号rHGH非还原处理 b’’ 2012017批号rHGH还原处理 c’’ 2012017批号rHGH非还原处理 扫描结果如下： 样品名称 主带扫描面积％ 分子量(Da) 98.5 22015 97.9 22204 99.5 22125 可见，半成品迁移位置一致，连续3批半成品扫描纯度达到95%以上，连续3批半成品分子量为22125±205.92，说明用非还原电泳检测蛋白纯度和用还原电泳检测蛋白分子量方法可信。 b. 分子量检测：（质谱法）使用对照品（Saizen HGH），加250(l无菌PBS溶解成100(g/ml，10ul分装。将对照品与样品做质谱检测，分子量均为22 125D。 图3－2对照品质谱图 图3－3 批品质谱图 c. HPLC纯度分析： 在方法建立之时，我们采用Saizen HGH对照品做对照，同时以原液缓冲体系做基线。 具体方法如下： 色谱条件 色谱主机厂家与型号：Waters 600 486 色谱柱厂家与规格：Waters C18 3.9×300mm 流动相：A: 10％乙氰+0.1％TFA B: 乙氰＋0.1％TFA 梯度： time flow A% B% 0 1 100 0 25 1 20 80 30 1 20 80 33 1 0 100 35 1 100 0 流速：1.0 ml/min 样品上样浓度：标示量为0.5mg/瓶，加纯化水溶解成1mg/ml 样品上样量：20ul 检测波长：280nm 结果如图：样品纯度97％ HGH标准品HPLC图谱 Name Retention Time Area % Area Height Int Type Amount Units Peak Type Peak Codes 1 22.038 1254590 100.00 55204 BB Unknown HGH原液冻干品 HPLC图谱 Name Retention Time Area % Area Height Int Type Amount Units PeakType Peak Codes 1 17.872 17179 0.70 453 BB Unknown 2 20.049 6966 1.09 275 BB Unknown 3 21.617 6990 1.30 1382 BV Unknown I06 4 22.077 591707 97.00 25451 VB Unknown 同时研究其它2个批号半成品，其保留时间、主峰面积如下： 样品名称 保留时间 主峰面积％ 标准品 22.038