不同基源党参种子冰冻切片技术探讨.pdfVIP

研究报告 RESEARCH REPORT 文章编号： （ ） 中图分类号： + 文献标志码： 1005-2690 2016 11-0112-02 S567.5 3 B 不同基源党参种子冰冻切片技术探讨 刘 玉 1 ，柴俊雯 1 ，陈红刚 1 ，陆国弟 1 ，杜 弢 *1,2,3 （1.甘肃中医药大学药学院，甘肃 兰州 730000 ； 2.甘肃省中药质量与标准研究重点实验室，甘肃 兰州 730000 ； 3.甘肃中医药大学药用植物遗传育种研究所，甘肃 兰州 730000 ） 摘 要：以不同基源的党参为试材进行冰冻切片，种子经过前处理、冷台固定、冷冻切片、展片、染色、观察并拍照等步骤，结果 表明，当冷台温度为 -20 ℃、OCT 包埋剂冷冻 5~8 min、切片厚度为 8~12 μm 时，可以获得较清晰的种子横（纵）切面图，切片 组织完整性和图片清晰度效果较好。 关键词：党参；川党参；素花党参；种子；冰冻切片；技术 冰冻切片是一种在较低温条件下使组织快速冷冻 种子切片基本没有影响 。 考虑经济方面 ，将种子用清水 到一定的硬度，然后进行切片的一种方法，且不经过脱 洗涤 3 次后，置于室温下在水中浸泡 12~24 h。 水和透明、浸蜡等一系列 的繁琐前期实验步骤，组织形 2.2 固定样品至冷台 态不会收缩，具有简便、快速、易操作、环境污染小等特 设定冷冻切片机温度（-20 ℃ ），将试验用的 毛笔 、 点[1] 。 常用于组织化学、免疫定位及原位杂交等研究，在 镊子放入冷冻切片机内一起降温。待温度降到 -15 ℃以 动物和人体的研究、临床手术中已被广泛应用[2] ，近年来 下时，用毛笔刷去除冷台上的薄霜。 将刀片固定在切片 也逐渐应用于药材的根、茎、花、果实和种子研究[3~5] 。 机的刀槽上 ，当冷冻箱温度降低至 -20 ℃时，将种子放 本试验以不同基源的党参为主要试材，在最短时间 在托盘上 ，然后滴加 OCT 包埋剂或胶水，用大头针使种 内制作出高质量的切片，试图建立一种适合于党参种子 子均匀地分散在包埋剂中。 然后置于冷台上 ，OCT 冷冻 快速、简便、高效的冰冻切片技术。 5~8 min 或胶水冷冻 20~30 mim ， 使材料迅速冷冻并能 1 仪器与材料 够牢 固地黏附在托盘上 。 1.1 仪器 2.3 切片 德国产 Leica-CM 1950 型恒冷切 片 机 ； 日 本 产 将托盘置于冷台固定槽上 ，调节旋转切片厚度的旋 Feather 一次性刀片；尼康 80i 显微成像系统。 钮 ，摇动旋转手轮进行切片。切片不可太厚 ，否则细胞容 1.2 试剂 易重叠而影响观察结果；也不可过薄 ，否则切片易碎 、不 70% 乙 醇 、1%番 红 水 溶 液 、0.1% 固 绿 乙 醇 溶 液 完整 。 经过多次试验，将种子切片厚度调为 8~12 μm ， （95%乙醇配制）、95%乙醇、OCT 包埋剂、 普通胶水、载 在切片的过程 中，切片刀上 的霜层较厚 ，应及时启动除 玻片、盖玻片、酒精灯、水合氯醛及 50%甘油。 霜程序去除霜层或者用毛笔刷刷掉 ，以防止卷片。 1.3 材料 2.4 展片 党参（Codonopsis pilosula （Franch. ）Nannf. ）素花党 用毛笔刷将切片移到载玻片上 ，或者直接将载玻片 参（Codonopsis pilosula Nannf. Var. mo