b第四章基因工程的常规技术上.ppt

３. Northern杂交 1979年，J. C. A1wine等人发展出了一种新的方法。 同Southern的DNA印迹杂交技术十分类似，所以叫做Northern杂交技术(Northern blotting)。为鉴别RNA的杂交技术。 Northern杂交的定义是：将RNA分子从电泳凝胶转移到硝酸纤维素滤膜或其它化学修饰的活性滤纸上，进行核酸杂交的一种实验方法。 4. Western杂交 为鉴别蛋白质的杂交技术。 蛋白质用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，将蛋白质从凝胶转移到一固相支持物上（如醋酸纤维素膜、PVDF膜），通过抗体与附着于固相的蛋白质所呈现的抗原抗体反应来对蛋白质进行检测。 转膜 4. Western杂交 Western杂交显像图片 5. 菌落原位杂交 对菌落中DNA进行原位鉴定 三、PCR技术 1. PCR技术的发现 聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction, PCR）方法始于20世纪70年代早期，有Khorana与其同事提出建议，作为一种降低化学合成基因工作量的策略。 其想法被遗忘，在1985年Kary Mullis及其Cetus公司的同事们，首次用大肠杆菌DNA 聚合酶I的Klenow片段体外扩增出哺乳动物基因片段。他们因此获得1993年诺贝尔生理学和医学奖。 但在发现耐热的Taq酶之前，PCR还不是成熟的技术。多种耐热聚合酶的发现，使PCR技术走向了每一个分子生物学的实验室。 目前PCR技术可扩增长达35-50kb的DNA片段。 PCR技术得到了快速的发展，在分子生物学研究中发挥着重要的作用。 1. PCR技术的发现 2. PCR技术的基本成分 （1）模板 （2） DNA聚合酶（如：Taq酶） （3）引物（一般18-30个核苷酸） （4）四种脱氧核苷酸的混合物 即：dATP、dTTP、dCTP、dGTP （5）反应的缓冲液 （1）模板 理论上讲一个DNA 分子也能扩出。一般来说，模板在反应体系中最低50pg也能扩出。 但是，模板量不可太多，太多容易糊掉。非特异扩增。 （2）DNA聚合酶 Taq DNA聚合酶，从耐热的水生嗜热菌（Thermus aquaticus）中分离出来，故名。扩增速度高，约1kb/min。因无校对功能，错掺比例为1/20000左右（1/300 ） ； Pfu聚合酶，扩增效率低，约600bp/min。因有校对功能，包真性好； Taq Plus，为Taq DNA聚合酶与Pfu酶按一定比例混合，保真性好、扩增效率高； Adventure黄金酶，保真性好、扩增效率高，但价格昂贵。 （3）引物 G+C含量，在40-60%之间，避免4-5个一样的碱基相连，如AAAA； 引物长度，在15-25个核苷酸, Tm值在55℃ 以上； 扩增长度，以300-500bp合适，也可长到几个kb，其3’碱基要求严格配对，避免为T； 引物尽量避免自身配对，避免引物内部出现二级结构； 引物的特异性，应与序列数据库中的其他序列具有显著差异； 引物上可加上酶切位点，对于接下来的克隆操作有利。 引物设计是关键！ （4）四种脱氧核苷酸的混合物 工作浓度一般为20-200μmol/L。浓度太高不好。 连续几次PCR 扩增时要注意补充四种脱氧核苷酸的混合物。 （5）反应的缓冲液 Mg2+的浓度可显著影响PCR 的产量、保真性、酶活力等，一般用量为1.5-2mmol/L。明胶、BSA、Tween20及DTT对酶有一定的保护作用。Tris-HCl（pH8.3）提供缓冲环境。 以上物质均保存于-20 ℃。 3. PCR技术的原理和过程 1. 变性温度，保证DNA双链解开，一般为94 ℃ 30s即可； 2. 退火温度和时间，PCR的特异性取决于退火过程中引物与模板的结合，一般在50-60 ℃之间 。退火温度越高，产物的特异性越高； 3. 延伸温度和时间，一般为72 ℃延伸，小于1kb的长度1-2min即可； 4. 循环数，一般在30-36左右，也可多到45个循环。但循环次数太多后，会增加非特异扩增的出现。 指数增长 变性 退火 延伸 3. PCR技术的原理和过程 PCR反应的温度循环周期 4. 荧光定量PCR 荧光定量PCR：通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合软件可对产物进行分析，计算样品的量，也叫实时定量PCR。 EB内插染料，SYBRgreen I内插染料，Taqman探针、Fret探针、Molecular Beacon探针技术等。 （1）内插染料 双链DNA的内插染料是一种能插入到双链DNA并发出强烈荧光的化学物质，其荧光强度的增加与双链DNA的数量呈正比。 如EB内插染料，SYBRgreen I内插染料等。 （2）双探针标记 探