基于甲基化DNA分离方法的甲基化DNA检测和全基因水平的甲基化分析.pdfVIP

中国实验室 生命科学仪器 2010第8卷/2月刊 基于甲基化DNA分离方法 的甲基化DNA检测和全基因水平的甲基化分析* 摘要 已知异常的DNA甲基化对基因表达有明显影响并且涉及包括癌症等的疾病以及正常状态，因此从非甲基化DNA 中鉴定甲基化DNA的分析技术是非常必须的。本文介绍了一种利用甲基化DNA结合域对甲基化DNA的亲和性质将甲 基化DNA从全基因中成功提取的甲基化DNA分离技术 （MeDIA）。结合MeDIA的PCR和CpG芯片技术分别实现了局部 位置甲基化DNA状态的评估以及全基因的甲基化分析。 NA甲基化是基因后修饰的一种，广泛存在于正 Materials, Newtown, CT）并且根据操作手册用Qia- 常状态和患有癌症等疾病的人群中。基因启动子的高 quick PCR纯化试剂盒 （ ）进行 [1] 甲基化已知对如抑制肿瘤基因的失活有重要作用 。 纯化。 因此，异常的DNA甲基化与肿瘤的发生和表达有高相 1.2重组MBD2bt蛋白的纯化 关性。由此，检测DNA上的甲基化CpG位点有着极大 His6标记的MBD2bt蛋白 （MBD2bt）由E. coli 的临床意义。 表达并参照操作手册用Ni-NTA琼脂糖磁珠 （Qiagen） 为实现此目标，目前的方法一般基于限制性内 进行纯化。MBD2bt洗脱液用存储缓冲液透析并在 切酶酶切、亚硫酸盐修饰或者单克隆抗体和甲基化 －20℃保存。 [2-4] DNA结合蛋白 （MBPs）的亲和作用 。所有这些 1.3基于MeDIA的PCR检测 方法都需结合下游的分析技术，例如以终端qPCR实 为了测试MBD2bt蛋白与甲基化DNA结合活性， 现基因座特异性甲基化测定；结合CpG微阵列实现基 体外甲基化DNA和非甲基化DNA，以及来自A549，正 [5-13] 因组水平的分析 。本文介绍的甲基化DNA分离分 常人支气管上皮细胞（NABE）和Hela细胞系的gDNA 析方法（MeDIA）采用了一种具有最小化的甲基化DNA 被用作实验模板。在MeDIA步骤中，MBD2bt与PCR 结合域的人MBD2b蛋白，并在组氨酸位进行标记 扩增的DNA或修剪的gDNA进行孵育。DNA和蛋白的 （MBD2bt）。这有效地保证了结合甲基化DNA的高灵 复合物被镍包裹的磁珠捕集，之后这些磁珠采用严苛 [14] 敏性 。而且，在分离过程中采用镍磁珠使实验操 的高盐缓冲液冲洗，将结合的甲基化DNA片段洗脱下 作更为方便。分离得到的DNA可以用PCR来测定基因 来。以基因特异性前体在优化的循环次数下进行PCR 座特异性的甲基化情况或者结合CpG芯片分析全基因 扩增，之后检测提纯的甲基化DNA的甲基化特异性信 范围的甲基化位点差异。 号，以分析特殊位置基因组的甲基化情况。 1.4基于MeDIA的CpG微阵列分析 1方法 MeDIA过程除了些微的修改基本如上。简单地 1.1 提取DNA 说，2μg MBD2bt蛋白在4℃与500 ng超声破碎的 基因组DNA（gDNA）用苯酚氯仿经标准步骤从 A549或NHBE细胞系gDNA振摇孵育8 h。富集到的 真核细胞中提取，并用乙醇沉淀。为了进行基于 甲基化DNA参照厂家建议用全基因扩增试剂盒